[发明专利]诱导蝴蝶兰2n花粉的时机及诱导方法

说明书

本申请公开了一种确定利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的时机的方法，包括：(a)天然2n花粉得率统计；(b)2n花粉诱导，包括：选择各个减数分裂时期的花粉，利用0.01％‑0.1％的秋水仙素溶液处理花蕾进行2n花粉诱导；(c)诱导后2n花粉率统计；和(d)将诱导后2n花粉率与天然2n花粉率进行比较，从而确定诱导2n花粉的时机。还提供了一种利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法。本发明确定了利用秋水仙素诱导2n花粉的时机，以及相应的秋水仙素浓度，为多倍体诱导获得2n花粉、培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新品种奠定基础。

技术领域

本发明属于多倍体育种技术领域，尤其涉及秋水仙素诱导蝴蝶兰产生 2n花粉的时机及诱导方法。

背景技术

蝴蝶兰是世界盆栽和切花市场上最重要的经济作物之一，其花形似蝴蝶，花色鲜艳而丰富，有“兰花皇后”的美誉。多倍体植株通常具有更大的器官和在逆境条件下更强的适应能力，多倍体兰花通常具有植株粗壮、花色艳丽、抗逆性强等优点。事实上，目前市场上流行的蝴蝶兰品种多是多倍体，蝴蝶兰属原生种的染色体数目为2n＝2x＝38，而栽培种的染色体大多不固定，主要为四倍体、三倍体和非整倍体。庄东红等(庄东红等，2007) 对38个蝴蝶兰品种或品系进行染色体计数及形态分析，认为四倍体占 82％。此外，大多数品种都是通过种间杂交或属间杂交产生的，由于倍性的差异，很难将原生种二倍体的优良基因转入商品杂交种，且蝴蝶兰的染色体大小差异也很大，不同染色体大小物种间杂交产生的后代大多不育，诱导蝴蝶兰加倍能克服杂种不育性。

自然界中多倍体植株的产生主要归因与2n配子的产生(Eng and Ho, 2019；Baduel et al.,2018；Van de Peer et al.,2017；Can et al.,2012)，与体细胞多倍体化相比，有性多倍体化具有遗传多样性和杂种优势(Lai et al., 2015；Younis et al.,2014；Brownfield and Kohler,2011；Ramanna and Jacobsen,2003)。前人报道的有未减数配子的植物科有34个以上(Dewitte et al.,2012；Sora et al.,2016)，其中柑橘(Ahmedet al.,2020；Sora et al.,2016) 等植物已经成功利用天然2n配子获得了多倍体后代。

2n花粉诱导是植物多倍体育种的重要途径。植物多倍体形成主要是通过体细胞加倍和2n配子产生。由于蝴蝶兰组织培养技术比较成熟，目前大多数研究是利用秋水仙素、安磺灵等化学试剂在组织培养条件下诱导外植体获得无性多倍化植株，但诱导后可能会产生大量嵌合体、非整倍体植株，而2n配子产生能很好的克服以上缺点。

前人在探究不同倍性蝴蝶兰产生后代的倍性时发现，二倍体与二倍体杂交能产生三倍体和四倍体，二倍体和三倍体杂交能产生五倍体，四倍体和四倍体杂交能产生五倍体和六倍体，这些现象均说明杂交亲本产生了 2n配子。朱娇等(朱娇等，2014)统计了部分二倍体、三倍体和四倍体蝴蝶兰天然2n花粉率，发现三倍体蝴蝶兰天然2n花粉率为2.39％，二倍体、四倍体较三倍体低分别为0.59％、0.67％。2n花粉相比于n花粉的竞争力较弱，自然条件下产生多倍体后代的几率较低，因此通过人工诱导增加2n花粉的比率是非常必要的(周晴等,2020；Younis et al.,2014)。

然而，现有技术中鲜有对蝴蝶兰采用2n花粉诱导来获得加倍植株，而且不能获得理想的2n花粉诱导率。此外，蝴蝶兰品种繁多，倍性及遗传背景复杂，为2n花粉诱导的研究增加了难度。

因此，为了培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新种质，亟需提供一种改进的2n花粉诱导方法来提高蝴蝶兰2n花粉诱导率。同时，还需要对更多的蝴蝶兰品种进行研究，为蝴蝶兰有性多倍化育种提供理论基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种确定利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的时机的方法、利用秋水仙素诱导蝴蝶兰产生2n花粉的方法。