[发明专利]人类血清素神经元TPH2报告基因细胞系的构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达血清素神经元TPH2报告基因的载体系统，其特征在于：所述的载体系统包括但不限于：

靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体，和

携带人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近同源臂的供体载体。

2.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于：

靶向人类血清素神经元TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体选自：PX330-sgT、PX458-sgT或者PX459-sgT。

3.一种稳定的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)构建携带靶向TPH2基因终止密码子附近的单链向导RNA的向导载体PX330-sgT；

获得靶向人类TPH2基因终止密码子附近的sgRNA，合成两条寡聚核苷酸链，退火并磷酸化后插入到PX330的BbSI位点，重组载体转化大肠杆菌，挑取单克隆菌进行测序验证重组成功的质粒PX330-sgT；

(2)构建报告基因供体载体的工具载体pUC19-T2A-EGFP-CMV-PuroR；

从AAVS1-TRE3G-EGFP中扩增出puromycin的抗性基因，克隆到FLAG-HA-pcDNA3.1-表达载体的CMV启动子后，得到pcDNA3.1-CMV-PuroR-polyA载体，从此载体中扩增CMV-PuroR-polyA序列，同时从PX458中扩增T2A-EGFP，将扩增的两个片段重组到pUC19载体的多克隆位点，得到工具载体pUC19-T2A-EGFP-CMV-PuroR；

(3)构建TPH2报告基因的供体载体TPH2-T2A-EGFP；

从人的基因组中扩增TPH2终止密码子前后分别1.5kb的左右同源臂，THL和THR，在工具载体的左右两侧的多克隆位点分别插入THL和THR，得到TPH2报告基因供体载体TPH2-T2A-EGFP；

(4)TPH2报告基因人多能干细胞系的构建；

将向导载体PX330-sgT和供体载体TPH2-T2A-EGFP电转到人多能干细胞H9(WA09,WiCell)，经puromycin筛选，获得抗性克隆后，提取细胞基因组进行PCR扩增鉴定插入片段，并测序，最终获得稳定的EGFP标记的报告血清素神经元TPH2基因的人多能干细胞系。

4.根据权利要求3所述的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：

所述步骤1)中构建向导载体的工具载体包括但不限于：PX330、PX458或者PX459中的一种或者几种。

5.根据权利要求3所述的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：

所述步骤2)中用于构建打靶载体工具载体的报告基因元件包括但不限于tdTomato,YFP,RFP或者EGFP中的一种或者几种。

6.根据权利要求3所述的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：

所述步骤2)中用于构建打靶载体工具载体的抗性筛选元件包括但不限于PuroR、NeoR。

7.根据权利要求3所述的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：

所述步骤3)是从工具载体pUC19-T2A-EGFP-CMV-PuroR出发，插入TPH2基因的左右同源臂。

8.根据权利要求3-7任意一项所述的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法，其特征在于：

所述步骤4)中电转的人多能干细胞系包括但不限于人胚胎干细胞系或者诱导多能干细胞系。

9.使用权利要求3-7中任意一种的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系的构建方法获得的血清素神经元TPH2报告基因人多能干细胞系。