[发明专利]一种自体外周血培养免疫细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种自体外周血培养免疫细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域，以解决冷冻保存过程中由于技术员的操作、环境以及冻存液性能的影响，使冻存细胞易受污染而影响其活性表达。本发明中，在现有的培养方式基础上改进了冻存步骤，加入了冻存稳定剂，主要成分有脯氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、甘油、柠檬酸钠、依克多因和Al ys‑Basa l基础细胞培养液，由于不含动物血清、二甲基亚砜及动物源成分的无血清细胞冻存液，没有引入外源性的动物源蛋白，降低了动物源污染的可能性，降低感染真菌和细菌的概率，甘油具有冷冻保护作用，可降低低温冻存对细胞的损害，提高保存效果。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种自体外周血培养免疫细胞的培养方法。

背景技术

自体细胞免疫疗法，是通过采血提取肿瘤患者体内不成熟的免疫细胞，在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和杀伤肿瘤细胞的能力后，再回输给肿瘤患者体内。

目前，体外细胞因子活化杀伤(Cytokine-induced killer cell，CIK)免疫细胞的培养方法属于自体细胞免疫疗法的一种，用于治疗广谱的肿瘤患者。CIK疗法的技术原理为：将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞；这群异质细胞中存在一类同时表达CD3⁺和CD56⁺两种膜蛋白分子的细胞，即NK细胞样T淋巴细胞(NKT细胞)，是对肿瘤细胞具有杀伤作用的主要效应细胞。由于CIK细胞具有增殖速度快、对正常的细胞无毒性作用、杀瘤谱广、安全性高等特点。因此，应用CIK细胞被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的重要方案之一。

自体外周血培养免疫细胞的培养法通常采用静态和间歇换液的方式进行扩增，再将已培养后的细胞冷冻保存，然而在冷冻保存过程中，由于技术员的操作、环境以及冻存液性能的影响，使冻存细胞受污染而影响其活性表达，因此，需要开发一种较为安全的自体外周血培养免疫细胞的培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自体外周血培养免疫细胞的培养方法。

本发明需要解决的问题：在冷冻保存过程中，由于技术员的操作、环境以及冻存液性能的影响，使冻存细胞受污染而影响其活性表达。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种自体外周血培养免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：

步骤A1，采集外周血，进行离心分离获得外周血单个核细胞和上层血浆，将上层血浆进行灭活、冻融、高速离心、过滤，得到自体血清；

步骤A2，向免疫细胞培养基中加入步骤A1制备的自体血清、IL-4和GM-CSF，得到培养基A；

步骤A3，向免疫细胞培养基中加入7DW8-5，得到培养基B；

步骤A4，向免疫细胞培养基中加入IFN-γ、IL-2和CD3单抗，得到培养基C；

步骤A5，向免疫细胞培养基中加入IL-2，得到培养基D；

步骤A6，取(5-10)×10⁷个外周血单个核细胞接种至培养瓶中，加入免疫细胞培养基、自体血清和培养基A，培养20-24h后，再加入培养基A，培养40-48h，吹打细胞并进行扩增，再加入免疫细胞培养基、培养基A和自体血清，培养20-24h，向其中加入培养基B和培养基C，吹打细胞并进行扩增，加入免疫细胞培养基、培养基D和自体血清，培养40-48h，得到目标细胞；

步骤A7，向目标细胞中加入冻存稳定剂形成细胞悬浮液，分装于冻存管，将冻存管放置程序降温盒中，先放置-80℃冷冻12h，然后转入液氮中长期冻存。