[发明专利]一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法

说明书

一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法属于检测技术领域，该方法包括以下步骤：(1)荧光探针制备；(2)试纸条检测条件筛选：偶联铕的单抗标记浓度、荧光探针用量、检测线上检测抗原浓度、检测线抗原喷涂速率(0.4～0.8μL/cm)；(3)时间分辨荧光免疫层析试纸条制备；(4)样品的检测：①样品前处理；②提取时间的筛选；③样品提取液稀释比例筛选；④检测分析，定性分析：紫外灯下，通过肉眼判断定性结果；定量分析：反应结束后30s内，采用荧光读数仪读取结果，得到被测粮食中百菌清的含量。本发明建立的百菌清残留的试纸条检测方法，具有准确度、精准度和重现性良好，操作简单快速，且具有可视的检测优势。

技术领域

本发明属于检测技术领域，主要涉及一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法。

背景技术

我国是农药的生产大国和使用大国。据统计，我国每年可生产农药382万吨，约占世界农药总产量的十分之一；施用量也远远高于世界平均水平，每年农药总使用量高达130万吨。农药的种类很多，根据其化学结构可分为有机类农药和无机类农药，其中有机类农药又可细分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类等，是当前农业领域应用最为广泛，同时也是残留和危害最为严重的农药种类。百菌清(chlorothalonil，CTN)是一种高效、广谱的有机氯杀菌剂，对多种作物的真菌病害有良好的防治效果，因此在我国的粮食、水果、水稻等作物生产中应用非常广泛。由于百菌清在植物上的黏着性较强，不易被雨水冲刷，难以降解且药效期较长等特点，极易在粮食和水果中残留，从而对农产品的质量安全造成影响。大量的研究表明，百菌清对鱼类和水生无脊椎动物具有明显的毒性，其中许多鱼类的96h半致死量(LC50)为10～195μg/L。除此之外，人们还发现长期低剂量的百菌清暴露甚至可以抑制青春期小鼠卵巢的发育

百菌清用检测方法为高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、色谱-质谱联用(GC/LC-MS)和免疫分析法。仪器方法的检测限低、专一性强，但由于其需要贵重仪器且样品前处理复杂、分析时间长，很难满足现场快速筛选、检测的要求。免疫分析方法成本低廉，选择性强，简单快速，近年来已经越来越多地应用于农药残留检测，其中时间分辨荧光免疫层析方法(Time-resolved fluorescence immunochromatographic assay，TRFICA)是以包埋了稀土元素离子螯合物的时间分辨荧光微球(Time-resolved FluorescentMicrospheres，TRFMs)为免疫探针，在层析体系中通过竞争反应体系进行检测的方法。利用其荧光衰变期长和发射光谱窄的特点，可使有效信号与非特异性的背景荧光信号区分，减少非特异性荧光的干扰，提高了灵敏度。通过荧光读数仪检测荧光强度比值，具有简单、快速和可视的检测优势。然而，时间分辨荧光微球作为免疫探针检测粮食中农药残留的免疫层析检测方法鲜有报道。本发明基于百菌清抗原抗体特异性结合反应，建立基于稀土铕荧光微球作为检测信号，可快速检测百菌清残留。

发明内容

本发明旨在针对现有背景技术中存在的不足，而提供的一种快速检测粮食中百菌清残留的试纸条的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现，具体步骤如下：

(1)荧光探针的制备：采用铕纳米材料与单抗偶联制备荧光探针，取800μL0.2moL/L的硼酸缓冲液于2mL的离心管中，加入200μL聚苯乙烯荧光微球乳胶，涡旋混匀；将离心管置于数控高功率超声仪中超声12-18min，以使乳胶材料在溶液中均匀分散；加入40μL 15mg/mL的EDC水溶液，室温下涡旋振荡10-20min；然后14000r/min，10℃条件下高速离心10min，弃上清以去除过量的EDC，沉淀物用1mL硼酸缓冲液复溶，重复超声步骤；加入一定量的抗体水溶液涡旋混匀，并转移至摇床振荡器上室温振荡12h，使抗体与微球材料充分偶联；重复离心步骤，弃上清以去除未偶联的抗体，下层沉淀用1m L含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，再次重复超声步骤使其均匀分散；随后转移至摇床振荡器上室温振荡2-5h，以封闭微球材料表面的未结合位点；待反应完成后，将制得的探针于4℃条件下保存备用。。