[发明专利]检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法

说明书

本发明公开了检测pHLA复合物中抗原肽的超滤‑高效液相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对pHLA复合物进行超滤处理，去除游离的抗原肽；(2)使用酸性溶液对pHLA复合物进行处理；(3)对步骤(2)获得的溶液超滤，收集抗原肽溶液；(4)HPLC测定抗原肽溶液中的抗原肽含量。本发明所建立超滤‑HPLC法实现了pHLA复合物中抗原肽的定量检测，可用于pHLA复合物的质量控制，也可用于制备条件探索过程中对少量pHLA复合物制备产物的检测鉴定。

技术领域

本发明属于蛋白与多肽互作研究技术领域，具体涉及检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法。

背景技术

HLA-I类分子(human lymphocyte antigen class I molecules)是由高度多态性的重链跨膜糖蛋白(HC)和β2微球蛋白(β2m)组成的异源二聚体。内源性抗原经抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)处理后，产生与HLA-I类分子结合的抗原肽(又称抗原CTL表位肽)，通过APCs的抗原递呈作用，被CD8+ T细胞抗原受体(TCR)特异性识别，诱导形成细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)克隆产生免疫应答。HLA-I类分子HC的α1和α2结构域形成抗原肽结合槽，抗原肽结合槽底部有6个小袋状凹陷(A→Fpocket)，其中A pocket和F pocket上的保守氨基酸与多肽N末端氨基和C末端氨基形成氢键，对结合的抗原肽起到固定作用。同一等位型的HLA-I类分子通过识别多肽序列上特定的锚定氨基酸残基(anchor amino acid residues)，可以结合多种抗原肽。筛选不同肽与HLA-I类分子相互作用形成HLA-I类分子/抗原肽复合物(pHLA复合物)的研究有助于发现新抗原CTL表位肽，对于阐明CD8+ T细胞特异免疫识别机制，研制多肽疫苗及发展特异性细胞免疫治疗都具有重要意义。而且在pHLA基础上发展的HLA四聚体技术也为CTL的特异性检测与研究提供更直接、有效的方法。

目前获得pHLA复合物的常用方法是分别重组表达HC和β2m，在复性缓冲液中结合抗原肽后获得。然而pHLA复合物的人工复性过程受复性缓冲液体系包括HC、β2m、抗原肽的摩尔数之比、pH值和温度以及电解质条件的影响，复性效果不易控制，耗时长，且容易形成HC二聚体和极度不稳定的空载HLA分子。因此在其制备过程中，需要对制备产物进行检测以优化复性条件，促进HC、β2m的正确折叠及与抗原肽之间相互作用形成pHLA复合物。此外由于HLA的高度多态性，不同型别的HLA-I类分子又可通过识别多肽基序结合多种抗原肽，理论上可形成无数种pHLA复合物。筛选与HLA-I类分子相互作用的抗原肽、研究pHLA复合物生物学功能、或者探索pHLA复合物制备条件，往往采用少量的复性缓冲液制备体系，不仅成本低，而且易于操作。

目前验证制备pHLA复合物成功与否的常用方法有Western blot、ELISA以及层析分离技术等方法。使用HLA-I类分子构象特异性抗体W6/32进行Western blot、ELISA等方法是验证少量制备pHLA复合物成功与否的最常用方法，其中W6/32是抗HLA-I类分子的单克隆构象抗体，能识别HC、β2m折叠后与抗原肽结合形成HC-α2区的特定表位，与单独的β2m不能结合，与单独的HC仅有极微弱结合。但基于构象特异性抗体W6/32进行Western blot、ELISA等方法只能定性检测pHLA复合物是否形成，并不能定量检测pHLA复合物中结合的抗原肽。而且有研究表明体外稀释复性获得的pHLA复合物可能具有不同的构象，但具有相同的生物学活性。这种构象差异有可能无法被构象特异性抗体W6/32特异性识别而导致鉴定结果具有不确定性。因此对于pHLA复合物的质量检测及制备条件探索过程中对少量pHLA复合物制备产物的检测鉴定还需要寻找其他方法，亟待建立一种能够定量检测重组pHLA复合物中的抗原肽的方法。

发明内容

本发明公开了检测pHLA复合物中抗原肽的超滤-高效液相色谱法，可用于pHLA复合物中结合的抗原肽的定量检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：