[发明专利]一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法

说明书

本发明公开了一种特立帕肽hPTH(1‑34)的生产和纯化方法，属于基因工程领域。该方法包括：将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人特立帕肽hPTH(1‑34)的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；培养工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；将融合蛋白的聚集体进行切割，得到所述人特立帕肽hPTH(1‑34)。本发明纯化得到的特立帕肽hPTH(1‑34)的产量和纯度都很高，而且该纯化方法对设备要求低，步骤少，操作简便，生产效率高，成本低，可应用于特立帕肽hPTH(1‑34)的高效制备中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法。

背景技术

成熟的人甲状旁腺激素(hPTH)是由甲状旁腺分泌的一种含有84个氨基酸残基的多肽。这种激素是儿童神经、骨骼、肠道和血液中钙、磷和维生素D活性形式的主要调节者(Murray等，2005)。研究表明，甲状旁腺激素(hPTH)N端的34个氨基酸与完整的甲状旁腺激素(hPTH)具有相似的生物活性。这种34个氨基酸的肽就是特立帕肽(hPTH，1-34)(Cheng和Gupta，2012)。特立帕肽hPTH(1-34)的相对分子质量为4117.75，它由34个天然氨基酸组成，其序列为：H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。它能促进骨形成，增加骨量(Elaena Quattrocchi等，2004)。特立帕肽hPTH(1-34)这种特性使其被用作骨质疏松症药物(Sepideh Abbaszadeh等，2019)。

骨质疏松症是一种以低骨密度和骨组织结构退化为特征的疾病，可导致骨骼脆弱，增加骨折的易感性，尤其是髋部、脊柱和腕部。2002年11月，美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准了特立帕肽(hPTH，1-34)，用于治疗“骨折高危”的男性和绝经后妇女的骨质疏松症。这是首次对促进骨骼合成代谢的药物给予了监管许可(R.Marcus，2011)。礼来公司是特立帕肽的原研企业，它采用基因重组表达获得特立帕肽(专利US6590081)。2015年，美国礼来公司的特立帕肽药物Forsteo全球市场份额达到15.6亿美元。中国是全世界骨质疏松人数最多的国家，有数据显示目前我国骨质疏松患者为9000万人，预计到2025年该数字将上升到1.5亿，特立帕肽的市场潜力巨大。

临床使用的特立帕肽(hPTH，1-34)主要是传统基因工程方法生产，特立帕肽hPTH(1-34)已在不同宿主中以重组形式生产，如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和哺乳动物细胞系(Vad等，2005；Liu等，2007)。在大肠杆菌中生产重组特立帕肽hPTH(1-34)的问题之一是表达后其结构固有的不稳定性。由于特立帕肽hPTH(1-34)分子量低，易于被宿主细胞蛋白酶消化，因此，从1988年开始，通过融合蛋白生产特立帕肽hPTH(1-34)(SepidehAbbaszadeh等，2019)。常用的融合标签有β-半乳糖苷酶标签(Yuji Suzuki等，1998)，GST促溶标签(Zhaoyang Xiu等，2002)，Trx促溶标签(Sanaz Yari等，2017)和pH响应的CspB标签(Takahiro Nonaka等，2019)。目前的特立帕肽hPTH(1-34)产生与纯化方法，其过程需用酶去除标签，并且要进行比较繁琐的纯化步骤，需要采用多种柱层析技术，如亲和层析、凝胶排阻层析等，收率低，成本较高，导致特立帕肽的产品价格高。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法。