[发明专利]一种高热稳定性重组AA9家族多糖单加氧酶及其应用

说明书

本发明提供了来源于短颈粪壳菌的一种高热稳定性重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A及其应用。所述重组AA9家族多糖单加氧酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的多糖单加氧酶SbLPMO9A在毕赤酵母X‑33中成功表达，并可氧化作用于纤维素底物，在C1位置对其糖苷键进行氧化切割。SbLPMO9A具有较高的热稳定性，即使在70℃下保温72h仍能维持72％的酶活。当SbLPMO9A与商品化纤维素酶Celluclast1.5L协同作用时，可将Celluclast1.5L分别降解可再生无定形纤维素、PFI‑打浆预处理的漂白桉木纸浆和脱木质素麦秆的还原糖产量最高提高83％、43％、65％。SbLPMO9A具有优异的热稳定性，且能促进纤维素酶对底物的水解效率，在木质纤维素的生物炼制中具有重要应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地涉及一种高热稳定性重组AA9家族多糖单加氧酶及其应用。

背景技术

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，在生物燃料和生化工业中具有巨大的潜力。纤维素作为木质纤维素基质中占比最高的成分具有非常高的应用价值，但前提是需要通过一些预处理方法将其解聚成更易利用的单糖。传统的酶解法通过将纤维素酶混合物与纤维素在一定条件下共同孵育从而达到将纤维素水解成单糖的目的。然而由于纤维素结晶区的顽固性，使得纤维素酶对纤维素的催化效率受到了极大的限制。因此，如何提高酶解的催化效率，降低酶解成本一直是生物燃料和生物化学行业面临的巨大挑战。

AA9家族裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是一种铜离子依赖酶。它通过氧化断裂糖苷键的方式作用于纤维素表面顽固的结晶区。当它与传统的纤维素酶同时降解底物时，能够显著促进纤维素酶对底物的催化效率。正因如此，多糖单加氧酶的发现对于木质纤维素的生物质降解具有重要意义。目前，对于C1-氧化型多糖单加氧酶的报道有限。同时，在实际的生物炼制过程中，酶的热稳定性是木质纤维素酶解的必要前提。大部分多糖单加氧酶在温度超过60℃长时间保温后极易失活，影响其实际应用效果。因此挖掘新的来源的AA9家族C1-氧化型高热稳定性多糖单加氧酶对多糖单加氧酶的研究以及提高木质纤维素的降解效率具有重要的意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种高热稳定性重组胞外AA9家族多糖单加氧酶。本发明另一目的是提供上述高热稳定性重组AA9家族多糖单加氧酶的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种重组高热稳定性AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A。

所述重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A来自于短颈粪壳菌Sordariabrevicollis；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A的重组表达载体pPICZαA-SbLPMO9A由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

包含上述重组载体的重组毕赤酵母工程菌株X-33-SbLPMO9A的构建及筛选方法，步骤如下：

S1：用限制性内切酶对重组载体pPICZαA-SbLPMO9A进行线性化；

S2：通过电击转化法将线性化酶切产物转入毕赤酵母X-33中，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株X-33-SbLPMO9A。

所述重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A的表达和纯化。

所述重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A热稳定性的测定。

所述重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A氧化区域选择性的测定。

所述重组AA9家族多糖单加氧酶SbLPMO9A在降解纤维素或木质纤维素中的应用。