[发明专利]一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法

说明书

本发明公开一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法，包括以下步骤：(1)将氯化石蜡溶于有机溶剂，得到氯化石蜡溶液，并向其中加入血清，静置平衡后得到底物体系；(2)向底物体系先后加入磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体和NADPH酶再生体系，摇匀后得到最终反应体系，然后置于37℃水浴中振荡反应；(3)向步骤(2)的反应体系加入冰冷的有机溶剂终止反应，然后进行离心，取上层清液，测定氯化石蜡含量。本发明采用血清作为氯化石蜡的载体，促进氯化石蜡与肝微粒体反应，显著提高氯化石蜡的代谢清除率，实现肝微粒体离体代谢氯化石蜡的代谢清除率的测定。

技术领域

本发明涉及一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法。

背景技术

氯化石蜡(CPs)是一类氯代烷烃类混合物，主要应用于金属加工业和塑料工业。它是我国产地环境和农产品污染最严重的卤代有机污染物之一。根据碳链长度，氯化石蜡可分为短链氯化石蜡(SCCPs，C_10-13)、中链氯化石蜡(MCCPs，C_14-17)和长链氯化石蜡(LCCPs，C_18-20)。研究显示，氯化石蜡对动物具有生殖毒性和发育毒性。

现有技术中，通过动物肝微粒体离体代谢卤代有机污染物是研究其在动物体内代谢转化机制的重要手段，后者是评价其生物毒性大小的重要因素。但目前尚无肝微粒体离体代谢氯化石蜡的报道。现时肝微粒体离体代谢卤代有机污染物的方法包括以下步骤：采用DMSO溶解卤代有机污染物；在反应体系中加入磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体、卤代有机污染物的DMSO溶液；将反应体系置于37℃水浴锅预孵化5min后，加入NADPH酶再生体系，反应开始计时；然后加入冷甲醇终止反应，再加入有机溶剂萃取三次，合并萃取液，氮吹干后，加入初始流动相复溶，上机检测卤代有机污染物。值得注意的是，由于DMSO对酶具有一定的毒性，反应体系中DMSO的体积不得超过最终反应体系的1％。所以，由于底物溶液体积在最终反应系统中所占比例如此之小，为了准确量取底物溶液，并且考虑尽可能的节约反应原料，现有技术中最终反应体系通常设置为1mL。

氯化石蜡在动物体内代谢清除规律的研究是探讨其生物富集性的关键因素，后者是氯化石蜡对生态/健康风险评估的重要因素。测定卤代有机污染物的肝微粒体离体代谢清除率是模拟其在动物体内代谢清除规律的常用方法。但是采用现时的肝微粒体离体代谢卤代有机污染物的方法对氯化石蜡进行实验，难以测定其代谢清除率。这是由于现时检测氯化石蜡浓度的方法的灵敏度相对较低，需要采用较高浓度的氯化石蜡作为底物进行实验才能满足后续检测的需求；但由于肝微粒体代谢能力有限，其对底物的代谢清除率通常随着底物浓度的增加而降低，在参考其他卤代有机污染物的肝微粒体代谢条件时，即使采用能够满足氯化石蜡后续检测方法的最低浓度0.2μg/mL，也很难观察到氯化石蜡的消耗。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法，实现肝微粒体离体代谢氯化石蜡的代谢清除率的测定。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法，包括以下步骤：

(1)将氯化石蜡溶于有机溶剂，得到氯化石蜡溶液，并向其中加入血清，静置平衡后得到底物体系；

(2)向底物体系先后加入磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体和NADPH酶再生体系，摇匀后得到最终反应体系，然后置于37℃水浴中振荡反应；

(3)向步骤(2)的反应体系加入冰冷的有机溶剂终止反应，然后进行离心，取上层清液，测定氯化石蜡含量。

本发明向氯化石蜡溶液加入血清，并静置平衡，使得高度疏水的氯化石蜡与血清有效结合，在后续反应中血清作为氯化石蜡的载体，促进氯化石蜡与肝微粒体蛋白酶反应，提高氯化石蜡的代谢清除率。

所述步骤(1)血清加入的体积为氯化石蜡溶液的1～10倍。