[发明专利]一种高效异源合成罗汉果甜苷V前体的方法

说明书

本发明涉及一种高效异源合成罗汉果甜苷V前体的方法，并提供了一种经突变的细胞色素P450s酶。该酶不仅能够在异源宿主中高表达，而且能明显提高底物选择特异性和目标产物11H‑Cuol的产率，有力推进了罗汉果甜苷V工业合成技术的发展。

技术领域

本发明涉及一种高效异源合成罗汉果甜苷V前体的方法，属于生物工程领域。

背景技术

高糖饮食，不管是天然还是人工合成的糖类，都会造成一系列现代健康问题，如肥胖、糖尿病、心血管疾病等(Sievenpiper,2014)。因此，植物来源的天然非糖物质因其高甜度、低热量、安全度高等优势，成为满足甜味需求的新一代甜味剂。其中罗汉果的主要活性物质罗汉果甜苷V甜度是蔗糖的250-300倍，热量低，且具有止咳祛痰、降血糖、抗癌、抗氧化等药理活性(Kasai et al.,1989)。因此，罗汉果甜苷V可代替蔗糖作为甜味剂广泛应用于各种食品，作为肥胖症或糖尿病患者的代糖。但罗汉果生长周期长，栽培存在诸多困难；且果实中罗汉果甜苷V含量低；传统获取方法已经难以满足日益增长的需求(Makapugay etal.,1985)。而近年来快速发展的组学促进了关键合成通路的解析与关键功能基因的发掘。代谢工程和合成生物学的快速发展为植物天然产物的异源生物合成提供了可持续生产思路。2018年，Iktin等人根据罗汉果转录组和基因组数据，解析了罗汉果甜苷V合成通路，为利用合成生物学构建细胞工程、实现体外合成奠定了基础(Itkin,2018)。

科学家们对罗汉果甜苷V的异源生物合成开展了一些初步探究，主要表现在以下几方面。一，底盘菌的选择和优化。合适的底盘细胞是天然产物高效生产的基础。例如酿酒酵母的MVA途径能够提供罗汉果甜苷异源合成的前体2,3-环氧角鲨烯，但酵母中大部分2,3-环氧角鲨烯会被羊毛甾醇合酶(ERG7)分流进入麦角固醇通路。科学家们通过ERG7抑制剂R048-8072处理或利用缺乏ERG7的酿酒酵母菌株(GIL77)作为底盘菌，增加了2,3-环氧角鲨烯到罗汉果甜苷V的代谢流(Dai et al.,2015)。二，葫芦二烯醇的生物合成。李守连等在酵母中过表达三萜化合物合成关键酶以及氧化鲨烯环化酶SgCDS，并进一步改善不同基因表达比例，葫芦二烯醇产量可达1724.10mg/L。虽然葫芦二烯醇不是罗汉果甜苷合成的骨架物，但可利用体外P450氧化酶、糖基转移酶的催化，生成罗汉果甜苷V(罗祖良et al.,2016)。三，体外糖基化修饰。天津工业生物所孙媛霞课题组鉴定到了糖基转移酶UGT74AC1,从大肠杆菌中纯化的UGT74AC1可以在体外以甜甙的共同前体物质(罗汉果醇)为底物，对其C3-OH进行糖基化生成甜甙IE(Dai et al.,2015)。

科学家们已经探索了一条罗汉果甜苷的异源生物合成途径(如图1)。我们发现目前获得罗汉果甜苷V前体主要依赖代谢工程的方法，将途径中所需关键酶进行异源组装，并没有对这些酶在原核系统中进行适应性改造，这将导致关键酶的酶活和稳定性受到一定程度的影响，不能发挥最大功能。因此，关键酶的适应性改造对于天然产物的高效生产至关重要。另一方面，我们可以发现现有合成方法依赖于原有途径，基本上是在原有途径的基础上逐个实现每一步反应，虽然有可能实现异源生物合成，但罗汉果甜苷V合成路径复杂，这将是一个漫长的过程。为了高效快速合成罗汉果甜苷V，需要缩短路径并对关键酶进行功能改良。11H-Cuol是葫芦二烯醇到罗汉果醇的合成过程的中间化合物，是罗汉果甜苷V的前体物质(如图2)。11H-Cuol合成关键酶属于细胞色素P450s，催化效率低且在异源宿主中的表达量很低，这些因素限制了罗汉果甜苷V前体的生产效率。现有技术也尚未对该酶进行适应性改造，导致其酶活和稳定性受到一定程度影响，进一步影响了罗汉果甜苷V的生产效率。因此，本项目将专注于实现葫芦二烯醇到罗汉果醇的合成路径中关键酶细胞色素P450s的功能改良。