[发明专利]一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒及其使用方法，涉及蛋白检测技术领域。本发明试剂盒包括第一裂解液、第一封闭试剂、第二封闭试剂、第二裂解液、羟胺反应缓冲液、第三裂解液、第三封闭试剂、生物素标记物、HRP抗体，使用方法包括一次封闭、还原、二次封闭、洗脱和检测。本发明引入离心管柱的使用，结合两种实验方法，针对不同的样品处理需求，都能很好的减少样品损失，缩短样品处理时间；解决了耗时长，在清洗beads过程中容易吸走beads损失样品的问题，使整个实验在24h内完成，不易损失样品，兼容WB和质谱检测方法。

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，特别是涉及一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒以及一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒的使用方法。

背景技术

现有技术公开了棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式之一，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中起着重要的作用，其中，通常是饱和的16个碳的棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys的巯基上。传统的用于检测棕榈酰化修饰蛋白质的方法是用放射性棕榈酸盐代谢标记培养细胞，通过放射自显影检测同位素标记的程度，但该法操作繁琐，使用放射性同位素有害且处理费用高，且只能用于检测活细胞中的棕榈酰化修饰蛋白质，存在灵敏度不高，缺乏直接富集和鉴定放射性标记蛋白质的方法等缺陷。现有技术中对蛋白质棕榈酰化通量分析的方法主要有两大类，其中一大类是以“棕榈酸盐为中心”的分析方法，即用含叠氮或炔基的棕榈酸盐类似物代谢标记培养细胞，通过化学选择性连接如施陶丁格连接或点击化学方法，选择性地将带叠氮或炔基基团的蛋白质连接到生物素或荧光基团上，富集或检测棕榈酰化修饰的蛋白质；该类方法不能分析组织样品和体液，可能会更偏向棕榈酸盐更新较快的蛋白质，棕榈酸盐类似物的引入可能会导致无法预测的生物学效应；另一大类方法是“以半胱氨酸为中心”的方法，即蛋白质提取后，先用碘乙酰胺或N-乙基顺丁烯二酰亚胺等完全封闭蛋白质Cys上所有自由巯基，再利用羟胺(HA)选择性地切开蛋白质Cys和脂肪酸修饰基团之间的巯酯键，产生新的自由巯基，再用合适的试剂如具有巯基特异反应活性的试剂等反应，将其转化成二硫键连接的生物素，再进行纯化、检测S-棕榈酰化修饰蛋白质；该法为间接检测和纯化方法，假阳性率相对较高。

鉴于现有技术存在的缺陷，本申请的发明人拟提供一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒及其使用方法。

发明内容

本发明提供了一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒及其使用方法，解决了以上问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒，包括：

第一溶液：为第一裂解液，由1.5ml吐温-100、0.91g三羟甲基氨基甲烷、1.31g氯化钠、6.5ml盐酸，加双蒸水至150ml刻度后制得PH7.5的混合液，于4℃保存；

第二溶液：为第一封闭试剂，采用1M TCEP阻燃剂,4℃保存；

第三溶液：为第二封闭试剂，采用0.5M NEM试剂,-20℃冻存；

第四溶液：为第二裂解液，采用1.5ml吐温-100、0.91g三羟甲基氨基甲烷、1.31g氯化钠、6.5ml盐酸、加双蒸水至150ml刻度后制得PH7.2的混合液，于4℃保存；

第五溶液：为羟胺反应缓冲液，采用1M HAM培养液,-20℃冻存；

第六溶液：为第三裂解液，采用1.5ml吐温-100、0.91g三羟甲基氨基甲烷、1.31g氯化钠、6.5ml盐酸，加双蒸水至150ml刻度后制得PH6.2的混合液，于4℃保存；

第七溶液：为第三封闭试剂，采用1M IAA吲哚-3-乙酸试剂,于-20℃冻存；

第八溶液：为生物素标记物，采用5mM Biotin-BMCC巯基反应的生物素交联剂，于-20℃冻存；