[发明专利]一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法

说明书

本发明涉及一种β‑乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β‑乳球蛋白残留量的方法。抗原表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS。测定β‑乳球蛋白残留量的方法为：S1：合成β‑乳球蛋白作用表位肽。S2：将β‑乳球蛋白作用表位肽制备为完全抗原。S3：制备单抗或多抗。S4：以步骤S3的单抗或多抗为一抗，采用间接竞争ELISA方法检测不同蛋白酶水解β‑乳球蛋白的水解液中β‑乳球蛋白残留量。本发明通过间接竞争ELISA方法实现β‑乳球蛋白的测定，以β‑乳球蛋白的AA12～37抗原表位肽作为免疫原，利用该免疫原制备测定所需的抗体。制备的抗体对β‑乳球蛋白水解物中残留的含有作用表位的肽段有极高的特异性，检测更加准确。

技术领域

本发明属于生物技术和食品技术领域，具体涉及一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法。

背景技术

牛乳是非常优质的蛋白来源，也是常见的过敏物质之一，其致敏性对婴幼儿的身体健康造成了严重的影响。牛乳蛋白过敏通常在婴儿期更为严重，会引起包括皮肤、胃肠道、呼吸道等的反应，甚至更严重的系统过敏反应或休克。

牛乳中蛋白含量丰富，每升牛乳含有约30-35克蛋白质，含有超过25种不同的蛋白质，从理论上讲，任何一种蛋白质都有潜在致敏性。目前普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白及α-乳白蛋白是牛乳中主要的过敏原。而乳清中最重要的过敏原是β-乳球蛋白，占总乳蛋白的10％，以及α-乳白蛋白，占总乳蛋白的5％。

通过限制或改变饮食来预防婴儿过敏性疾病早已被提出。但是，牛乳蛋白往往作为配料被添加到各种食品中，难以从饮食中消除。另外，对于处于骨骼生长期的儿童，牛乳是钙的重要来源。为此，现有技术选择向牛乳蛋白中添加蛋白酶，对致敏蛋白进行作用表位的水解。蛋白酶水解后的牛乳蛋白，其结构被破坏，成为分子量较小的多肽。然而，不同种类的蛋白酶对β-乳球蛋白的水解能力不同，仍然存在水解位点特异性不强，过敏原残留量较高，水解物苦味较重等问题。因此，对水解后的牛乳进行抗原残留量检测必不可少。

目前牛乳中β-乳球蛋白的检测方法包括聚合酶链反应(PCR)检测方法、色谱检测方法以及免疫学检测方法。

PCR检测方法具有高特异性和敏感性，但是存在一些不足，特别是在食品中添加蛋白质时，很难将核酸检测结果准确换算成蛋白质含量，这使得PCR的方法不适用于过敏原的评估和管理。此外，PCR检测方法主要用于检测核酸含量高的食品，然而，牛奶并中没有与过敏原相关的DNA。

色谱学检测方法包括高效液相色谱法、超高效液相色谱法及液相色谱-质谱联用法，但是色谱质谱的仪器价格高昂，前处理复杂繁琐，成本高昂。

ELISA是食品工业和政府食品检测机构最常用的方法，具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单、高通量、速度快等优点。根据ELISA检测的类型，可分为间接竞争型ELISA和三明治型ELISA，其中间接竞争型ELISA更适合于检测分子或小分子。当β-乳球蛋白被水解破坏成小片段后，间接竞争型ELISA的检测结果更为准确。但是，对于存在交叉过敏反应的过敏原，即对于存在相似作用表位的过敏原间，ELISA法常出现假阳性。

因此，需要提供一种能够精准、快速检测牛乳过敏原残留量的检测方法，以筛选出能够有效降低过敏原致敏性的蛋白酶，降低牛乳中过敏原的含量。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术中存在的水解后的牛乳中β-乳球蛋白抗原的残留检测困难的问题，本发明提供一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：