[发明专利]一种重组噬菌体的构建方法

权利要求书

1.一种青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）重组噬菌体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤

（1）提取丝状噬菌体复制型DNA；

（2）制备带有目的基因的Tn5转座子DNA；

（3）体外插入转座子DNA：取等摩尔量的丝状噬菌体复制型DNA和转座子DNA，在Tn5转座酶的作用下，37℃孵育2h；

（4）转化大肠杆菌DH5α λpir：采用热激法，利用步骤（3）获得的反应物转化经氯化钙处理制备的大肠杆菌DH5α λpir感受态细胞；

（5）制备混合质粒文库：收集步骤（4）的大肠杆菌转化子，加入液体培养基，混匀，利用SDS碱裂法提取混合菌液中的质粒；

（6）转化宿主细胞：采用电激法，利用步骤（5）提取的混合质粒文库转化丝状噬菌体的宿主细菌，经筛选，获得转化子；

（7）筛选重组噬菌体：随机挑取多个经步骤（6）的转化子，接种于液体培养基中，震荡培养，离心，滤过上清液；将滤液与丝状噬菌体的指示细菌混合培养，于不同时间点检测指示细菌的抗性来判断重组噬菌体的活性；

（8）检测目的基因的表达：将具有活性的重组噬菌体感染宿主细菌，提取感染后细菌的总蛋白，使用外源目的基因所编码蛋白的抗体，通过蛋白免疫印迹检测目的基因的表达情况；

其中，步骤（1）中丝状噬菌体为青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的丝状噬菌体RSCq，其复制型双链环状DNA共计7480bp，序列见SEQ ID No.1；

步骤（2）中Tn5转座子DNA两侧为Tn5转座酶的识别序列，且内部包含丝状噬菌体复制型DNA在大肠杆菌中复制所需的复制起始位点ori、用于筛选卡那霉素抗性的Kan^R基因、以及带启动子和翻译元件的目的基因；

步骤（2）中目的基因为通过商业化基因合成服务合成的由lac启动子控制的降解青枯雷尔氏菌群体感应信号分子的酯酶elp104 DNA，序列见SEQ ID No.2；

步骤（3）的反应体系为：RSCq复制型DNA 5 µL、转座子DNA 3 µL、EZ-Tn5 10X 反应缓冲液 1 µL、EZ-Tn5 转座酶 1 µL，总计10µL。