[发明专利]脱落酸在促进人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板中的用途

权利要求书

1.脱落酸在制备人诱导多能干细胞体外分化为巨核细胞和血小板促进剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

其中，所述促进剂中，脱落酸的浓度为10 ~ 25μmol/L。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

其中，所述促进剂中，脱落酸的浓度为10 μmol/L。

4.一种提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）第-3天：将人诱导多能干细胞以5-10×10⁴/mL的密度接种在Matrigel预处理的六孔板中，运用赛贝培养基进行培养；

（2）第0天：当细胞克隆密度＞70%后，将细胞消化成单细胞；按照3000-4000个细胞/

孔、每孔中添加50 μL无血清培养基的方式将溶液加入U型底96孔板中，随后1500 rpm，5 min离心，置于37℃、5 % CO₂ 孵箱中培养；所述无血清培养基中含10 ng/mL BMP4、10 ng/mL bFGF、10μM ROCK抑制剂Y27632和10 μmol/L脱落酸；

（3）第2天：按照50μL/孔加液补充无血清培养基，所述无血清培养基中含10 ng/mL

BMP4、10 ng/mL bFGF、20 ng/mLVEGF、50ng/mL SCF和10 μmol/L脱落酸；

（4）第5天：按照50μL/孔加液补充无血清培养基，所述无血清培养基中含10 ng/mL

BMP4、10 ng/mL bFGF、10 ng/mLVEGF、50ng/mL SCF和10 μmol/L脱落酸；

（5）第8天：每孔弃100μL液体，后加液补充50μL无血清培养基/孔，所述无血清培养基中含10 ng/mLBMP4、10 ng/mL bFGF、10 ng/mLVEGF、50ng/mL SCF和10 μmol/L脱落酸；

（6）第11天：加液补充50μL无血清培养基/孔，所述无血清培养基中含10 ng/mLBMP4、10ng/mL bFGF、10 ng/mLVEGF、50ng/mL SCF及60ng/mL TPO和10 μmol/L脱落酸，TPO的终浓度为20 ng/ml；

（7）第14天：收集EB细胞分泌的造血细胞，将细胞转移至6孔板中培养，培养液为2mL 无血清培养基/孔，继续培养5天；所述无血清培养基含20 ng/mL SCF、10ng/ml IL 11、50 ng/mL TPO和10 μmol/L脱落酸；

（8）第19天：收集巨核细胞。

5.根据权利要求4所述的提高人诱导多能干细胞体外巨核分化效率的方法，其特征

在于，还包括人诱导多能干细胞细胞复苏以及传代培养的步骤，

所述细胞复苏过程包括如下步骤：

（1）将细胞培养液置于37℃水浴锅中预热；

（2）将细胞冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出后立即于37℃水浴锅中摇晃冻存管，使

细胞快速解冻，至液体中尚余小冰块时迅速取出，转移至超净台中，加入1mL培养液混匀后，1500rpm，5min离心；

（3）弃去上清，向冻存管中加入预热的培养液，重悬细胞，计数后种至6孔板中，

十字法使细胞混合均匀；

（4）将6孔板放置于37℃，5% CO₂培养箱中孵育；

所述传代培养过程包括如下步骤：

（1）准备matrigel铺板的六孔板；

（2）将赛贝培养液置于37℃水浴锅中预热；

（3）将细胞培养板从培养箱中取出，显微镜下观察其生长状态及密度，细胞克隆密度达70%~80%可传代；

（4）将人诱导多能干细胞培养皿置于超净台中，用无菌移液枪弃去上清，取1mL PBS，至培养皿中将细胞洗涤一次，弃去PBS；

（5）取1mL 0.05mM EDTA加入培养皿中，轻轻震荡，使其充分平铺于细胞表面，镜下观察细胞克隆边缘卷起，细胞已经变圆，用移液枪吸去EDTA，用移液枪加入2ml赛贝培养液，轻轻吹下培养皿底部的细胞，根据细胞克隆密度，以不同的密度传代至铺Matrigel的6孔板中；

（6）24h后观察细胞密度，待细胞克隆密度至70%~80%时进行下一次传代。