[发明专利]一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂、其制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于RT‑RPA方法的微量核酸释放剂，其包括TritonX‑100、Tween‑20、异硫氰酸胍、乙醇、异戊醇和水。本发明提供的微量核酸释放剂，所需的原料价钱便宜，易于获得，且对身体无害。该微量核酸释放剂可快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放核酸，可大大缩短核酸提取纯化的时间，无需复杂的操作步骤，操作简便。本发明的微量核酸释放剂所需样本量少，可对微量珍贵样本进行检测。本发明的微量核酸释放剂可以直接对血清、全血、血浆、咽拭子、粪便等样本核酸进行提取，无需加热，离心等复杂步骤，只需要一步加样过程，30分钟内即可完成核酸的提取和释放过程。

技术领域

本发明涉及一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂、其制备方法及应用，属于生物试剂技术领域。

背景技术

核酸提取技术是分子生物学研究的基础，现已广泛应用于病原微生物检测、环境微生物检测、食品安全检测等领域。传统的核酸提取物理方法有煮沸法、磁珠法、超声波法等；化学方法有表面活性剂、碱裂解法等；生物方法主要有酶法等。目前，提取核酸释放剂存在的主要问题有细胞裂解不完全，造成核酸释放不彻底，所得核酸不稳定尤其是RNA，受温度、酶等因素易降解；细胞内蛋白含量较高，且含有大量抑制核酸检测的物质，造成提取试剂与检测体系不匹配，因此还需要采用传统方法利用多步骤、多种不同试剂等来去除PCR反应的抑制剂。

RT-RPA是与荧光定量PCR最为相似的检测技术，该方法具有较高的灵敏度及特异性，但是其没有一个成熟的引物探针筛选规则，只能通过设计和筛选大量的引物探针，形成灵敏度高、特异性强的检测试剂。微量核酸释放剂与PCR相结合的检测方法报道较多，但目前未见微量核酸释放剂与RT-RPA方法相结合检测病原微生物的文献报道。

目前核酸提取技术迅猛发展，但仍存在一些缺点，比如，苯酚氯仿抽提法虽然采用了实验室常见的试剂，做起来成本比较低廉。但是使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，且需要反复抽提，核酸的回收率较低，损失量较大。磁珠法虽安全无毒，但是成本较高。离心柱法虽有利于RNA保护，但需要较多的样本，耗材多，且需反复离心，不便于高通量、自动化操作。

传统的PCR方法所需的时间较长，需要变性、退火、延伸等多个步骤，通常1-2小时才能完成核酸检测。如何能快速实现核酸有效提取，是亟需解决的技术问题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂、其制备方法及应用，其与RT-RPA的检测方法相结合，对(血清、血浆、粪便等)样本实现进行快速、灵敏的检测目的。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂，其包括Triton X-100、Tween-20、异硫氰酸胍、乙醇、异戊醇和水。

如上所述的微量核酸释放剂，优选地，所述Triton X-100按体积百分比占0.03～10％，所述Tween-20按体积百分比占0.03～10％，所述乙醇按体积百分比占10～30％，异戊醇按体积百分比占15～25％，余量体积为无酶无菌水，所述异硫氰酸胍的终浓度为40～80mmol/L。

如上所述的微量核酸释放剂，优选地，所述Triton X-100按体积百分比占0.05％，所述Tween-20按体积百分比占0.05％，所述乙醇按体积百分比占25％，异戊醇按体积百分比占20％，余量体积为无酶无菌水，所述异硫氰酸胍的终浓度为50mmol/L。