[发明专利]在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统

说明书

本发明提供了一种在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统。具体地，本发明提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统，所述筛选系统包含：(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与用于检测旁切的第一可检测标记物共表达；(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达。本发明的筛选系统可高通量的筛选或确定基因编辑蛋白是否具有旁切效应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及在细胞和成体水平检测蛋白质旁切效应的系统。

背景技术

CRISPR-Cas13系统最近已被用于降解酵母，植物，哺乳动物细胞系和动物中的RNA。Cas13诱导的旁切作用可为大肠埃希氏菌提供抗MS2噬菌体的免疫力，并在核酸检测(SHERLOCK)中得到了很好的应用。但是，在哺乳动物细胞和成体动物中是否存在由Cas13介导的敲除引起的旁切影响一直是一个有争议的问题，这阻碍了Cas13的临床应用。

因此，本领域迫切需要开发一种快速、灵敏和系统的旁切效应评估平台。

发明内容

本发明目的就是提供了一种快速、灵敏和系统的旁切效应评估平台。

本发明的另一目的在于在哺乳动物细胞上瞬转快速筛选旁切效应高或者低的基因编辑蛋白、在稳转dox系统上评估基因编辑蛋白长时间表达对细胞增殖和转录组的影响，以及在体内验证基因编辑蛋白的安全性和旁切强弱。

在本发明的第一方面，提供了一种用于筛选是否具有旁切效应的基因编辑蛋白的筛选系统，所述筛选系统包含：

(a)待筛选的基因编辑蛋白，所述基因编辑蛋白能够识别靶标核酸分子并对所识别的靶标核酸分子进行切割，并且所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物共表达；

(b)gRNA，所述gRNA靶向靶标核酸分子，所述靶标核酸分子编码第二可检测标记物，并且所述gRNA与第二可检测标记物共表达；

其中，当第一可检测标记物的强度显著降低时，则表明所述基因编辑蛋白为具有旁切效应或旁切效应强的基因编辑蛋白；当第一可检测标记物的强度的降低幅度小，则表明所述基因编辑蛋白为不具有旁切效应或旁切效应弱的基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物通过自剪切蛋白连接。

在另一优选例中，在启动子(比如，CAG、EF1α、CMV、PGK)存在下，所述基因编辑蛋白的编码序列与第一可检测标记物的编码序列共表达。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白与第一可检测标记物通过不同的启动子连接，分别表达。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK)启动子来驱动所述基因编辑蛋白的表达。

在另一优选例中，所述第一可检测标记物通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK)启动子来驱动所述第一可检测标记物的表达。

在另一优选例中，所述gRNA与第二可检测标记物通过不同的启动子连接，分别表达。

在另一优选例中，所述gRNA通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK、U6)来驱动所述gRNA的表达。

在另一优选例中，所述第二可检测标记物通过启动子(比如CAG、EF1α、CMV、PGK)来驱动所述第二可检测标记物的表达。

在另一优选例中，所述第二可检测标记的表达量提高时，第一可检测标记物的强度显著降低。

在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。