[发明专利]病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用

权利要求书

1.病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用，包括以下步骤：步骤一，假病毒体系的构建；步骤二，假病毒活性的检测；步骤三，假病毒用于新冠疫苗免疫效果的评估；其特征在于：

其中在上述步骤一中，根据国家生物信息中心2019新型冠状病毒信息库公布的SARS-CoV-2S蛋白基因突变位点分析数据，S蛋白的突变主要分为ACE2结合区域-非关键互作氨基酸、ACE2结合区域-关键互作氨基酸和非ACE2结合区域，随后选择数据库中变异位点毒株数量较多且传播范围较广的突变位点进行统计，根据新型冠状病毒基因组序列号GenBank:MN908947，密码子优化合成S蛋白全长基因序列并连接真核表达质粒pcDNA3.1(+)得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike；在构建S蛋白突变体时采用点突变的方式对真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike进行反向PCR，正反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，引物设计时将引入突变包含在互补区域内；对目标质粒扩增后对产物消化，去除甲基化模板质粒后进行重组反应；反应产物转化并进行克隆鉴定，测序正确即为突变成功的S蛋白突变体表达质粒；上述S蛋白突变体表达质粒分别与HIV-1骨架质粒pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞即可获得S蛋白突变体假病毒；同时未突变的S蛋白表达质粒与pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞后得到新型冠状病毒S蛋白假病毒；

其中在上述步骤二中，将构建的不同S蛋白突变位点的表达质粒分别与HIV-1骨架质粒pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞后可包装出不同突变位点的S蛋白假病毒，将这些突变的假病毒统称为“SARS-CoV-2S蛋白假病毒盘”；由于pNL4-3 Luc+R-E-质粒中带有表达荧光素酶的报告基因，假病毒盘在感染易感细胞后可以使细胞内表达荧光素酶基因；因此在加入荧光素酶底物后根据化学发光仪检测细胞内的RLU，可以判断不同突变位点的假病毒感染能力强弱；在构建假病毒盘之前已经成功构建了SARS-CoV-2易感细胞系HEK293T/hACE2；S蛋白假病毒盘构建成功后，我们将对假病毒盘感染HEK293T/hACE2细胞的能力进行检测：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×10⁴/孔密度铺于96孔板，第2天将滴定后的不同S蛋白假病毒标准化后加入到96孔板中，设置不含假病毒的完全培养基作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；根据RLU的数量级即对易感细胞的感染能力将假病毒盘中的不同突变体进行分级，并对这些位点突变导致病毒感染能力改变的原因进行分析并找出与受体作用的主要位点；

其中在上述步骤三中，目前SARS-CoV-2疫苗正在或逐步在国内进行各阶段的临床试验，我们将对接种过各品牌疫苗的人群进行血清收集并记录血样采集距离疫苗接种的时间，记录血样采集距离疫苗接种的时间为0-12个月，同时采集未接种人群血清作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，假病毒盘测试收集血清的中和实验结果，综合评估各疫苗对SARS-CoV-2突变后的交叉免疫保护效果；另外根据各样本采集时间确定疫苗接种人群体内产生抗体可以维持的时间，为后续SARS-CoV-2疫苗的接种方案提供理论参考；中和实验流程如下：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×10⁴/孔密度铺于96孔板，第二天将疫苗第二次接种后2周的血清使用完全培养基按照2倍梯度稀释，初始稀释度为1:2，共设置8个梯度(1：2到1:256)；上述稀释后的血清与50μl滴定后的假病毒等体积混合，37℃孵育1h后加入预先铺好含有HEK293T/hACE2细胞的96孔板中，设置不含假病毒的50μl完全培养基和只加50μl假病毒组作为对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；根据检测出的RLU值可以有效评估疫苗对不同突变毒株的交叉免疫保护效果。

2.根据权利要求1所述的病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用，其特征在于：所述步骤二中，RLU的全称为Relative luciferase activity。

3.根据权利要求1所述的病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用，其特征在于：所述步骤三中，初始稀释倍数为1:2，稀释范围为1:2到1:256共8个梯度，设置3个平行。