[发明专利]一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法

说明书

本发明提供一种基于液质联用的α‑淀粉酶抑制剂的评估方法，该方法利用液质联用检测α淀粉酶酶促反应产物进而详尽、准确地反映α淀粉酶活性。本发明可以更加精细的测定α‑淀粉酶催化淀粉水解产生的所有产物，从而更为真实的量化酶促反应过程。本发明可对酶抑制剂研制提供更可靠依据；同时本发明可以避免在开发具有还原性以及荧光的抑制剂对于传统测定方法的干扰。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法及应用。

背景技术

餐后血糖的管理是糖尿病治疗和预防的重要方面。其中，抑制人体肠道中的α-淀粉酶活性进而降低由食物中淀粉向葡萄糖的转化，已经是治疗糖尿病的一种临床常用方法。因此如何高效、快速、精准的开发对于α-淀粉酶具有抑制活性的抑制剂，也一直是相关领域的研究热点。目前几乎所有的α-淀粉酶抑制剂开发都依赖于对酶活性的测定。一般来说，通过测定体外酶活反应体系最终的酶促反应的产物的量，进而反应酶的活力水平；并通过添加抑制剂，与对照组进行比较，评估抑制剂的抑制效果。目前常用的体外酶活测定方法方法有两大类，分别是还原糖测定法和人造底物法。

还原糖测定法是直接使用淀粉作为酶促反应的底物，酶促反应之后，通过各种显色的方法，如DNS或GOPOD法测定产物中还原糖的量，间接的反应酶活力水平。人造底物法是使用人工合成的改性淀粉，在淀粉链上连接荧光或者具有紫外吸收的基团，在酶水解这类底物的时候，通过检测到荧光或具有紫外吸收的基团从淀粉链中释放速率，进而反应没活力水平。但是这两类方法均存在一个弊端，既α-淀粉酶对于淀粉的水解，会产生包括聚合度在2至10不等的麦芽糖多聚物，这两大类方法都无法测定每一种产物具体的量，因此不能准确反映酶消化淀粉的真实过程，最终测得的仅仅是酶消化淀粉的一个表观形象。其次，还原糖法还有一个致命缺陷，就是当测试的酶的抑制剂具有还原性时，往往会导致测试结果的强烈干扰，以至于无法准确评价抑制剂的效果。人造底物法存在的重大缺陷是，其使用的是人工合成的底物，并不能准确、真实的反应酶催化淀粉水解的过程，而是一种近似的模拟。

因此，现有技术中目前仍需要探索新的适于α-淀粉酶检测的方法，有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的是寻求一种客观、准确的适于α-淀粉酶检测的方法基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法。为实现上述目的，本发明使用液质联用技术，使用天然淀粉作为酶促反应底物，直接从酶促反应体系中将所有聚合度的反应产物进行分离，然后通过质谱直接对各个产物进行定量。从而真实、客观、详尽的反应α-淀粉酶催化淀粉水解的过程。相较于传统方法仅能通过测定酶促反应产物还原性末端的总量或释放的荧光基团和紫外发色基团的总量而间接反映酶活的根本原理不同的是，本发明可以直接准确定量所有酶促反应产物的量，相较于传统方法在精细度上达到新的高度。同时，本发明还可以避免人造底物作为测定酶活反应所导致的失真；并且，由于前端色谱技术的加持，又可以避免在评价还原性抑制剂时产生的干扰。

本发明首先提供一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，包括如下步骤：

步骤1)样品处理：取经α-淀粉酶催化反应后样本，用甲醇、乙醇或者乙腈进行稀释，过滤后制备上样样本；

步骤2)液相分离：使用基于亲水作用的色谱柱进行分离，其中流动相为有机相和水相，所述有机相为乙腈、甲醇或乙醇，所述水相为甲酸铵或乙酸铵溶液；

步骤3)质谱检测：利用低分辨或高分辨质谱进行检测；

步骤4)数据处理：对数据进行绝对定量和/或相对定量处理。

进一步的，所述步骤1)中，采用与样本等体积的甲醇、乙醇或者乙腈进行稀释；所述过滤采用滤膜过滤，所述滤膜采用0.1-0.45μm的滤膜过滤；优选的采用0.22μm滤膜过滤；

进一步的，所述步骤2)中色谱柱包括但不限于Capcell Core PC色谱柱或Accucore150-Amide-HILIC色谱柱；