[发明专利]Lhx8在促进胆碱能神经再生中的应用

说明书

本发明公开了Lhx8在促进胆碱能神经再生中的应用，属于医药技术领域。本发明通过利用重组慢病毒Lenti6.3‑Lhx8使神经干细胞高表达Lhx8，从而诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化。本发明对胆碱能神经再生情况及其机制进行了进一步研究，为临床治疗阿尔茨海默病（Alzheimer Disease,AD）等神经退行性疾病提供新思路。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及Lhx8在促进胆碱能神经再生中的应用。

背景技术

中枢神经系统（Central nervous system，CNS）损伤后的神经再生是长期困扰人类的一大难题。神经干细胞(Neural stem cells, NSCs) 具备自我更新、多向分化潜能及迁移性等特征，使其成为人类神经系统损伤以及退行性疾病治疗的理想细胞。

海马中的胆碱能投射纤维主要来源于基底前脑内侧隔核（Medial septalnucleus, MS）和斜角带垂直臂核（Nucleus of the vertical limb of the diagonalband, VDB）。MS、VDB与海马结构中的齿状回（Dentate gyrus, DG）之间的胆碱能投射系统进行性损伤可导致海马区域乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）递质水平异常，动物出现学习、记忆等认知功能障碍的表现。目前已知海马齿状回是干细胞的聚集区之一。

有研究发现，切割穹窿海马伞后，海马齿状回门区和颗粒下层的自体及移植入的NSCs均能增殖、分化，LIM 同源域转录因子之一的Lhx8基因表达水平呈现短暂性上调，此外，切割穹窿海马伞侧海马提取液模拟海马神经再生微环境可明显促进海马NSCs分化为AChE阳性神经元。这些结果说明切割大鼠穹窿海马伞后海马中某些物质表达增强，诱导NSCs迁移和向神经元或胆碱能神经元分化。

发明内容

本发明的目的是提供了海马齿状回胆碱能神经再生的关键转录因子Lhx8，为神经干细胞向胆碱能神经元分化提供了新的思路。

本发明通过体内和体外实验发现，转染Lenti6.3-Lhx8慢病毒后并不能影响NSCs向神经元的分化，而海马NSCs高水平表达Lhx8后，促进了NSCs向ChAT阳性的胆碱能神经元分化，同时，齿状回中Lhx8基因和蛋白水平上调，能促进海马齿状回的NSCs增殖并分化为ChAT阳性的胆碱能神经。

附图说明

图1为MOI=50时的病毒数量感染海马NSCs，慢病毒转染3d后检测转染效率，可见EGFP绿色荧光（A）约占所有细胞（B）的50%（C）。标尺=50µm。

图2为NSCs体外分化培养7d后行MAP2/ChAT免疫荧光双标记，检测其向胆碱能神经元分化情况。在对照组（Control）及模拟组中（Mock）NSCs都能分化为MAP2阳性的细胞（A,F），但ChAT表达阴性（B, G）；而在过表达组（Lenti6.3-Lhx8）中见NSCs向MAP2/ChAT阳性的胆碱能神经元分化。统计学结果提示，Lenti6.3-Lhx8转染NSCs后，MAP2阳性的神经元数目无明显增多（P），但ChAT阳性的胆碱能神经元占神经元总数的比例明显增加（Q; **: P0.01），标尺=20µm。

图3为RT-PCR检测NSCs分化后，各组中Lhx8（A）和ChAT（B）基因表达情况。结果显示，与对照组（Control）和模拟组（Mock）比较，过表达Lhx8后Lhx8 mRNA（A）及ChAT mRNA（B）的相对表达量均明显上调，且差异具有统计学意义（**: P0.01）。

图4为Western Blot结果。各组在分子量41kD和61kD处可见明显的Lhx8及ChAT阳性条带，在慢病毒组（Lenti6.3-Lhx8）中，Lhx8（A）及ChAT蛋白（B）的相对表达量与正常组（Control）和模拟组（Mock）比较明显增高，差异具有统计学意义（**: P0.01）。