[发明专利]一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法

说明书

本发明涉及一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，将粗蚯蚓血红蛋白液采用双水相萃取制备高浓度蛋白液，高浓度蛋白液再经超滤纯化及层析分离后冻干成粉；双水相萃取的萃取剂由PEG6000、(NH₄)₂SO₄、NaCl和H₂O组成。本发明全程使用无毒试剂，所获得的蚯蚓血红蛋白提取率高，纯度高，活性好，耗时较短，可用于生物医学领域血红蛋白结构与功能精深研发。

技术领域

本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域，尤其涉及一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法。

背景技术

蚯蚓血红蛋白分子由于在某些方面具备独特优势，在国外已成为血红蛋白氧载体研发领域新靶标，但国内尚无从蚯蚓分离纯化活性血红蛋白方法的公开文献。

特定蛋白分离技术主要由目标蛋白理化特性决定，但不同方法在获得率、纯度、活性、效率等方面有明显差异。蚯蚓体内血红蛋白含量极低，易受多种混杂蛋白影响，活性保护困难，使用常规的蛋白分离技术提纯蚯蚓血红蛋白，很难在获得率、纯度、活性、效率等方面取得满意效果。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是：如何从蚯蚓中高效分离纯化活性蚯蚓血红蛋白。

为了解决上述的技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法包括以下步骤：

一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，包括制备粗蚯蚓血红蛋白液、超滤纯化、层析分离、制备冻干粉，其特征在于将粗蚯蚓血红蛋白液采用双水相萃取制备高浓度蛋白液，高浓度蛋白液再经超滤纯化及层析分离后制成冻干粉；所述双水相萃取的萃取剂由PEG6000、(NH₄)₂SO₄、NaCl和H₂O组成，PEG6000质量分数为10％-12％，(NH₄)₂SO₄质量分数为9％-11％，NaCl质量分数为范围为0.1％-1.0％，其余为H₂O。

双水相萃取的萃取剂各组方最佳质量分数为PEG6000 10％、(NH4)₂SO₄9％、NaCl0.5％，其余为H₂O。

本发明的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法要求在2-8℃低温环境中进行，所有操作需要轻柔。

双水相萃取时按以下进行操作：将粗蚯蚓血红蛋白液加入到萃取剂轻轻摇匀，于2-8℃环境，静置萃取3.4h-16.2h，收集下层红色液体，于12000r/min，2-8℃，30min离心，去沉淀，去上层少许淡黄色液体，得到高浓度蛋白液。

所述的萃取剂与粗蚯蚓血红蛋白液的质量比例比为4∶1-6∶1。

所述的制备粗蚯蚓血红蛋白液按以下操作进行：

1)将鲜活的蚯蚓用洁净水洗净；

2)将洗净的蚯蚓置于2-8℃纯水中2-4h，待蚯蚓腔内容物排出后捞出蚯蚓；

3)再用2-8℃纯水再次清洗，放入组织匀浆机中搅碎，制成蚯蚓组织匀浆；

4)将蚯蚓组织匀浆离心，取上层暗红色液体，再次离心，取上层清液即为粗蚯蚓血红蛋白液。

本方法全程在低温环境中进行，低温为2-8℃。

所述的超滤纯化为使用100kDa超滤离心管进行超滤纯化。

层析分离使用葡聚糖凝胶G200装柱，使用2-8℃0.9％NaCl水溶液洗脱。

制备冻干粉步骤包括层析分离所得的浓缩液体置于-20℃中完全冻结，再使用真空低温冷冻干燥机冷冻干燥。