[发明专利]一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，其特征在于，所述基因颗粒携载有治疗模块、靶向模块和锚定模块；所述超声造影剂是以O-CMC/DSPE-PEG为壳膜材料，液态氟碳为内核的纳米级超声造影剂；所述基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的电位为负电荷-12.98mV，粒径为160~220nm，分散系数为0.25~0.35；

所述治疗模块为siCAT-1序列，siCAT-1的核酸序列为：GAcAuAuucGcAGuGAucAuAuu；

所述靶向模块为A10-3.2适体，A10-3.2适体的核酸序列为：GGGAGGAcGAuGcGGAucAGccAuGuuuAcGucAcuccu；

所述锚定模块为胆固醇修饰的aWJ侧链；

所述基因颗粒的制备方法，包括步骤如下：

（1）根据3WJ-pRNA的核心序列分别设计合成4条RNA单链，分别为cholesterol修饰的aWJ侧链、A10-3.2修饰的bWJ侧链、siCAT-1修饰的cWJ侧链、治疗模块的反义链；

（2）将步骤（1）所述4条RNA单链分别溶解于DEPC水中后，混合均匀，分别得到RNA单链浓度为50~100μmol的DEPC水溶液；

（3）将步骤（2）所述4条RNA单链DEPC水溶液混合于退火缓冲液中，混匀后进行程序性降温，得到基因颗粒；

其中，步骤（1）中所述aWJ侧链的核酸序列为：uuGccAuGuGuAuGuGGG；所述bWJ侧链的核酸序列为：cccAcAuAcuuuGuuGAucc；所述cWJ侧链的核酸序列为：GGAucAAucAuGGcAAuu；所述aWJ、bWJ、cWJ、siCAT-1、A10-3.2核酸序列中所有嘧啶核苷酸均进行2’氟化修饰；

步骤（3）中所述含有4条RNA单链的退火缓冲液中RNA单链的摩尔比为1:1:1:1；所述程序性降温采用PCR仪进行，具体程序为：95℃，5min→每个循环下降-0.1℃，750个循环→4℃；在基因颗粒构建过程中实时监测产物荧光强度；在基因颗粒构建完成后，采用8%非变性凝胶电泳及原子力显微镜检测构建效率；

所述超声造影剂的制备方法，包括步骤如下：

1）将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、液态氟碳、吐温20分散于去离子水中，高速均质法制得混悬液；

2）高速机械搅拌下，向步骤1）制得的混悬液中逐滴加入O-CMC溶液，制得悬乳液；

3）将步骤2）制得的悬乳液室温静置5~10min，低速离心，取上层液体，经过滤后即获得超声造影剂；

其中，步骤1）中，各材料的用量分别为：5.0mL去离子水中含有8~12mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、250~300μL液态氟碳、10~15μL吐温20；

所述基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的制备方法，包括步骤如下：

a、将基因颗粒溶解于超声造影剂中，混合均匀，得到混合液；

b、将步骤a中的混合液在室温下，静置共孵育，低速离心5min，吸取上层液体，即得基因颗粒/超声造影剂纳米复合体；

其中，步骤a中，所述基因颗粒与超声造影剂的质量比为0.5：1；所述基因颗粒标记荧光cy3，超声造影剂标记荧光FITC；

步骤b中，所述共孵育时间为60min，低速离心转速为300~600rpm。

2.如权利要求1所述的靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，其特征在于，满足下列条件一项或多项：

i.步骤1）中，所述高速均质转速为16000~20000rpm，时间为0.5~1.5min；

ii.步骤2）中，所述O-CMC溶液的浓度为1~3mg/mL，O-CMC溶液与去离子水的体积比1：0.8~1.2，高速机械搅拌转速为12000~15000rpm，1~3min；

iii.步骤3）中，所述低速离心转速为300~600rpm，时间为4~6min，过滤为采用0.4~0.5μm的滤膜进行过滤。

3.权利要求1所述的靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体在制备抗肿瘤药物中的应用。