[发明专利]一种牡丹离体植株再生的方法及其应用

说明书

本发明涉及牡丹种植技术领域，尤其涉及一种牡丹离体植株再生的方法及其应用。所述方法包括：挑选牡丹诱导的胚性愈伤组织置于分化培养基中，以10～11天为继代周期，继代培养11～13代得到不定芽原基；所述分化培养基为：改良WPM+0.5～1mg/L CPPU+0.5～2mg/L TDZ；将所述不定芽原基经过不定芽伸长和生根诱导得到牡丹幼苗。本发明通过采用特定的分化方式，在同一分化培养基中诱导牡丹胚性愈伤组织形成分生结节，进一步分化出不定芽，解决了现有技术中牡丹分生结节分化率低的难题。本发明构建了一种牡丹离体植株再生的方法，通过分生结节途径实现离体培养条件下植株再生，为牡丹离体快繁、遗传转化提供新技术。

技术领域

本发明涉及牡丹种植技术领域，尤其涉及一种牡丹离体植株再生的方法及其应用。

背景技术

牡丹(Paeonia Sect.Moutan)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)落叶亚灌木，是中国传统名花，具有重要的文化、观赏、药用及油用价值(Li et al.,2015；Yu etal.,2016)。然而，嫁接、分株等传统繁殖方式效率低、周期长的缺陷限制其产业发展与育种进程。因此，迫切需要建立高效稳定的体外再生体系。牡丹的体外再生难度大，鳞芽快繁、胚胎培养和愈伤组织分化仍然存在玻璃化、繁殖率低、生根质量差和移栽困难等问题(Wen etal.,2019；徐莉等,2017；Zhu et al.,2015)，而体细胞胚发生也面临畸形率高、发芽率低的难题(Du et al.,2020；周秀梅等,2009；王政,2010)，现有技术始终没能建立完善的体外再生体系。

分生结节(meristematic nodule)是一种与体细胞胚外观相似，但具有明显组织学差异、能长期稳定增殖且具有高度分化能力的特殊结构，是建立体外再生的理想替代途径(McCown et al.,1988；钟原,2011)。分生结节因其独特的结构特征与优势，被定义为除器官发生(organogenesis)、体胚发生(somatic embryogenesis)外的第三种体外再生途径(George,1993)。通过对不同品种、外植体等培养材料和外源激素、培养基类型、蔗糖等培养条件的筛选，建立了桉树(Dobrowolska et al.,2017)、凤梨(Dal Vesco et al.,2011)、啤酒花(Fortes et al.，2010)、胡桃(Moyo et al.，2009)、杨树(Ferreira et al.，2009)、枫香(Bayraktar et al.，2015)等植物高效的分生结节离体再生体系。分生结节具有稳定的遗传特性和旺盛的分化能力，桉树结节继代培养3年仍能分化(Warrag et al.,1991)，百合分生结节悬浮培养4年以上仍能再生，且染色体含量无变化(Godo et al.,1998)；通过分生结节再生体系的建立，利用基因枪法在枫香和啤酒花上成功进行了转基因研究(Kim etal.,1999；Batista et al.,2008)，利用半连续液体培养红豆杉结节可持续生产紫杉醇(Ellis et al.,1996)。

牡丹分生结节研究起步较晚，目前对其的相关报道较少。牡丹分生结节起源方式为通过愈伤组织间接诱导(秦磊等，2012)。以紫斑牡丹‘高原圣火’(P.rockii‘Gao YuanShen Huo’)、亚组间杂种‘Golden Era’(P.lemoinei‘Golden Era’)叶柄薄层为外植体可分别实现85.7％、78.0％分生结节诱导率，并以液体培养方式进行了增殖培养，但‘高原圣火’的分生结节未实现分化，‘Golden Era’仅获得16％的分化率，没有成功获得再生植株(钟原,2011；秦磊，2012)；综上，牡丹分生结节诱导与增殖培养体系较为完善，但存在分化率低、多数品种不分化的难题，成为限制牡丹体外再生的瓶颈。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种牡丹离体植株再生的方法及其应用，通过特定的方式诱导得到牡丹分生结节，并分化成不定芽，解决了现有技术中牡丹分生结节分化率低的难题，这对于牡丹育种领域有重要意义。

第一方面，本发明提供一种牡丹离体植株再生的方法，包括：