[发明专利]一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种抗体‑明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用，所述方法包括：将明胶纳米颗粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，获得NHS基团功能化明胶纳米颗粒；将玻片于APTES无水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗涤，获得胺化处理玻片；将所述NHS功能化明胶纳米颗粒于所述胺化处理玻片上反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板；将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得的抗体‑明胶纳米颗粒修饰的芯片，可以捕获多个循环肿瘤细胞，并通过水凝胶的选择性光固化实现单个循环肿瘤细胞分离，避免了邻近细胞的干扰，保证了基因检测的纯度和准确性。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTCs)由于携带肿瘤患者的基因，是人类外周血中肿瘤转移的种子，可通过血液循环引起肿瘤增殖。作为肿瘤标志物，CTC可为肿瘤的早期诊断、临床治疗和术后疗效评价提供必要的依据。因此，近年来开发了多种CTCs分离平台。目前分离CTC的主要原理是基于细胞的物理性质、免疫磁珠、微流控器件、功能性质等。但需要注意的是，上述方法不可避免地分离出非靶向细胞。根据调查,主要的释放方法是通过外部刺激将捕获的细胞作为一个整体释放,然而，这样子收集的细胞可能含有非靶向细胞,这将导致CTC后续的基因检测结果可能不单单是CTC的结果.这就可能会导致有一个不准确的结果分析。因此，迫切需要开发一种单细胞释放平台来保证下游分析的准确性。近年来，许多单CTC基因突变分析被报道。据报道，单个CTC的分离方法有很多种，例如:显微操作、流式细胞术、激光捕获显微解剖、介质电泳分离等。

然而，现有技术中的这些方法都受到时间成本、操作复杂和效率低的限制，因此它们在CTC中的应用仍然有限。例如，激光切割分离单个CTC时，往往会将CTC从整个基底中剥离出来，这可能会因为基底的切割而干扰进一步的分析。还有一些其他的释放方法，比如通过外部刺激反应选择性释放单一的CTC,然而，这些不可避免的需要清洗步骤，这将导致细胞丢失，同时可能收集了靶向细胞和非靶向细胞，导致基因测试不准确。目前很难在不损失的情况下收集单个的CTC。维持细胞的高活性对于后续的细胞分析是至关重要的，有效的单细胞恢复平台能够保持细胞活力，对单个CTC的遗传分析是必要的。

因此，如何开发一种从患者血液中捕获并分离出活性较高的单个CTCs且效率高准确性高的方法或者材料工具，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用，该抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片可以捕获多个循环肿瘤细胞，再结合光固化水凝胶，可以从患者血液中分离出活性较高的单个CTCs，同时避免了邻近细胞的干扰，保证了基因检测的纯度和准确性。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，所述方法包括：

将明胶纳米颗粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，获得NHS功能化明胶纳米颗粒；

将玻片于APTES无水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗涤，获得胺化处理玻片；

将所述NHS功能化明胶纳米颗粒置于所述胺化处理玻片上反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板；

将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。

进一步地，所述EDC/NHS溶液为将(3.5～4.5)mg/mL EDC和(5.5～6.5)mg/mL NHS溶解在(0.05～0.15)M的MES溶液中配制而得。

进一步地，所述APTES无水乙醇中APTES的质量分数为4～6％；所述乙醇溶液的质量分数为70～90％。