[发明专利]一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法

权利要求书

1.一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，具体步骤如下：

（一）制备线性化载体

对载体进行单酶切或双酶切，以使载体线性化；并回收、纯化酶切后的线性化载体；

所述载体为pTRV2或pRI101-AN；

具体双酶切线性化时，采用EcoRI 、XhoI对pTRV2载体进行双酶切，采用NdeI、BamHI对pRI101-AN载体进行双酶切；

（二）设计并合成两条部分互补的长链寡核苷酸序列

设计并合成两条长链寡核苷酸片段Oligo F和Oligo R，两条长链寡核苷酸片段的序列的排列方式为：5’－载体同源序列＋酶切位点序列＋目的序列－3’；

其中，两条长链寡核苷酸片段序列的5’末端分别与所用线性化载体两端存在同源序列，两条长链寡核苷酸片段之间的3’末端目的序列存在部分互补序列；

目的序列的长度L=n1+n2-（a1+b1）-（a2+b2）-c；

其中：n1、a1、b1分别为Oligo F的总长度、Oligo F与载体同源序列的长度、载体一端酶切位点的长度；

n2、a2、b2分别为Oligo R的总长度、Oligo R与载体同源序列的长度、载体另一端酶切位点的长度；

同时，a1≥15 nt，a2≥15 nt；

c为Oligo F和Oligo R互补序列长度，c≥15 nt，且Oligo F和Oligo R 的3’末端互补序列的Tm值应≥40℃；

（三）制备目的序列

对Oligo F、Oligo R进行退火处理；

（四）同源重组

将步骤（三）中退火后产物与步骤（一）中线性化载体进行单链重组；

（五）转化、筛选，获得重组载体

将步骤（四）中单链重组后产物进一步转化大肠杆菌并进一步进行筛选验证。

2.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，具体50 μL酶切体系及反应条件设计如下：

pTRV2载体或pRI101-AN载体，2000 ng；

内切酶1，2 μL；

内切酶2，2 μL；

10x Cut smart buffer，5 μL；

ddH₂O，补足至50 μL；

37℃酶切过夜。