[发明专利]一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法

说明书

本发明公开了一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，步骤如下：收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；对悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有CD9(‑)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；对筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入扩增培养后的肾前体细胞中；将转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库。本申请的修复型多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，将其移植到病人体内，可起到重建肾小管结构、修复肾脏损伤的作用，且免疫原性不会改变，临床应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及细胞库构建技术领域，具体是一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法。

背景技术

肾脏为通过将由生物体内的代谢活动产生的有害物质等废物从血液中过滤而除去以谋求维持身体的健康而起作用的重要的器官之一。目前，急慢性肾脏疾病导致的肾功能衰竭严重威胁人类健康，困扰着全国近1.5亿肾病患者。传统的药物治疗和透析治疗难以逆转肾脏结构的损伤和肾功能的持续下降。在此情况下，除了异体肾移植手术外，基于成体组织干细胞(前体细胞)移植的再生医学新技术有望为临床上治疗这类疾病带来新的思路。所以，本申请欲构建一种多能干细胞库以用于急慢性肾脏疾病的治疗，具有重大的科学和临床意义。

发明内容

本发明就是为了解决现有技术中存在的问题，所提出了一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法。

本发明的一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，是采用了如下的技术方案。

一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法，包括以下步骤：

S1.收集尿液，离心收集细胞并洗涤，然后重悬细胞；

S2.对步骤S1得到的悬浮细胞进行筛选，筛选得到含有CD9(-)、CD106(+)、CD140a(+)和CD140b(+)细胞表面标志的SOX9阳性肾前体细胞；

S3.对步骤S2筛选得到的肾前体细胞进行扩增培养；

S4.将表达多能干细胞诱导因子的质粒转入步骤S3扩增培养后的肾前体细胞中；

S5.将步骤S4转入质粒后的细胞在诱导培养基和人胚胎干细胞培养基中培养，得到修复型多能肾前体干细胞库。

通过采用上述技术方案，本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到SOX9+肾前体细胞，再将其重新编程为多能性干细胞，最终得到修复型多能肾前体干细胞库，整个细胞库的构建过程简单，构建得到的多能肾前体干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。

具体的，本申请从尿液来源的细胞群中筛选得到SOX9+肾前体细胞，SOX9是一种转录因子，在急性肾损伤早期SOX9表达升高，在急性肾损伤28d后，SOX9依旧处于较高的表达水平，并且约有40％的SOX9+细胞在肾损伤后增殖并扩增。所以，SOX9+细胞具有很强的增殖和分化能力，可促进受损肾小管上皮细胞的修复，从而实现肾小管结构的重建、肾脏损伤的修复。

本申请再将筛选得到的SOX9+肾前体细胞诱导出干性，得到自我更新、增殖和分化能力进一步增强的SOX9+肾前体干细胞，肾前体干细胞在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、增殖能力、分化能力、拟胚胎和畸形瘤形成方面都与胚胎干细胞相似。而且，肾前体细胞经体外诱导成肾前体干细胞，再移植到病人体内，其免疫原性不会改变，相当于自体移植，从而避免了胚胎干细胞面临的伦理学问题和免疫排斥的问题。

另外，本申请将尿液作为肾前体细胞的来源，具有样本方便采集、易于大量获得、无创性等特点。