[发明专利]一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用

说明书

本发明属于疫苗研制技术领域，具体为一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用，该VLPs由H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白和M1蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；因为该VLPs免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和M1抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的抗体，所以其可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫；因此，利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。

技术领域

本发明涉及疫苗研制技术领域，具体为一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

禽流感是由A型流感病毒感染引起的家禽和野生禽类的高度接触性传染病。根据禽流感病毒致病性的高低，可以将禽流感分为高致病性、低致病性和非致病性。引起H9N2亚型禽流感的病原属于低致病性流感病毒，虽然其致死率不高，但常导致家禽呼吸道症状、产蛋率下降，且容易引起并发感染，给养禽业造成严重的经济损失。疫苗免疫是预防禽流感最有效和最经济的手段，对提高我国的禽病防制水平，保障我国养禽业的健康发展具有十分积极的意义。目前国内用来预防H9N2亚型禽流感的疫苗主要是灭活疫苗。灭活疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。由于禽流感病毒易突变，且双重及多重亚型病毒之间易发生遗传物质重组及抗原漂移，使灭活疫苗的长期安全性及有效性受到了极大挑战，难以应付新的突变型禽流感病毒的传染，因此研制更有效的疫苗来预防和控制H9N2亚型禽流感至关重要。

由于病毒样颗粒疫苗的免疫效果及其安全性优于灭活疫苗，因此成为近年的研究热点。病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，可模拟病毒粒子的天然结构，能够激活细胞免疫和体液免疫，诱导的免疫保护更为全面。利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产VLP疫苗。由于杆状病毒表达系统不依赖鸡胚生产，能够保证禽流感大流行时疫苗的充足供应，且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势，因此利用杆状病毒表达系统生产的VLP疫苗具有较大的应用潜力。

前期研究发现利用流感病毒的四种蛋白，即M1、M2、NA和HA，可以组装形成流感病毒VLPs，因此，当时对流感病毒VLPs的相关研究主要集中在这四种结构蛋白上面。后来研究表明，用流感糖蛋白(单独HA或HA和NA)和基质蛋白M1构建的禽流感VLPs，同样能够刺激机体产生大量的特异性抗体，且被免疫的实验动物均能抵抗同源或异源同亚型病毒的攻击。因此，在构建禽流感VLPs时，当HA和M1在细胞中共表达时，无论是否有NA，都会自发形成VLPs。

据此，本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统，使H9N2亚型禽流感病毒HA 蛋白和的M1蛋白在该系统中自行组装形成空心化结构的VLPs。因为该VLPs 免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和M1抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和 NS抗体，所以其可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫。因此，利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

因此，本发明的目的是提供一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用，能够实现利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用，其包括如下步骤：