[发明专利]一种检测乙肝外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种检测乙肝外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用。所述传感器包括工作电极：表面固定有捕获探针巯基标记的DNA纳米支架；靶物质T链诱导的级联链置换反应(L‑TEDCR)体系：级联T型结构复合物Ts、级联反应辅助链Fs，Ts由DNA单链P链、R链、L链和L₀链组成，所述Fs由DNA单链F链、L₀链组成；以及MOF/DNA级联酶放大检测体系。外泌体miRNA加入后，L‑TEDCR被快速触发，产生大量DNA纳米支架；产生的DNA纳米支架固定在电极上，与MOF/DNA级联酶结合，从而产生用于检测外泌体miRNA的显著放大的电化学信号。本发明的传感器具有灵敏度高、检测速度快、特异性好等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测乙肝外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染严重威胁人类健康，HBV感染标志物众多，包括临床上较常使用的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎病毒定量(HBV DNA)以及近年来新型血清学标记物，包括乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B core associatedantigen，HBcrAg)、HBV前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)等。现有外周血病毒学标记物检测手段虽然对于诊断、疗效监测等方面各有优势，但仍不能很好地代替肝组织共价闭合环状DNA(covalently closedcircular DNA，cccDNA)检测，因而需要更多的研究去探索更好的血清学指标。

外泌体1983年首次于绵羊网织红细胞中被发现，大小约为30-150nm，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，一些特定的外泌体被检测为不同肝病的血清标志物。研究发现HBV可编码HBV相关microRNA，将其命名为HBV miR21，HBV miR21在肝癌细胞系中高表达，其在肝炎活动的患者中与HBV DNA呈正相关。目前，检测外泌体miRNA的常用方法是定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。然而，这种方法费时费力，因此促使研究人员开发快速和高灵敏度的新方法来准确测量外泌体miRNA。

最近，熵驱动循环反应(EDCR)，催化发夹组装(CHA)和杂交链反应(HCR)等无酶信号放大方法被探索用于miRNA的放大检测。为了明显提高反应速度，参与信号放大传感系统的可扩散反应物被组装在一个紧凑的空间中。例如，Ju等人设计了一种定位的HCR，即发夹探针交替结合到滚环扩增(RCA)产生的长DNA链上进行mRNA的检测，与传统的HCR相比，表现出极快的反应速度。类似地，Wei等人开发了一种用于miRNA成像的定位CHA，其中CHA反应物通过多条单链杂交被固定在组装的DNA纳米线上。虽然传感系统中的局域化的反应底物可以大幅度提高反应速度，但这些策略存在以下缺陷：i)局域底物的构建需要多个组装步骤，导致费时费力；ii)可扩散反应物与DNA纳米线的杂交效率在物理条件下可能较低，直接导致定位结构不完全；iii)CHA和HCR的固有特性，例如不可接受的循环泄漏和严格的反应条件，即二价金属离子(如Mg²⁺)总是对分析性能有不利影响，限制了它们在早期肿瘤诊断中的进一步应用。此外，泄漏可能更严重，因为紧凑空间中增加的DNA发夹数量更容易发生非特异性相互作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测乙肝外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用，基于局域化的级联链置换反应和MOF/DNA级联酶作为电化学标签，建立一种新型的电化学传感器，实现乙肝外泌体miRNA的高灵敏和快速检测。