[发明专利]一种白细胞抗原结合多肽

说明书

本发明公开一种白细胞抗原结合多肽，应用基因工程技术构建表达载体，高效表达一种CD3单链抗体并进行快速纯化的方法和技术，通过构建目的基因的原核的表达载体，选取大肠杆菌作为表达宿主，通过高密度发酵，获得目的蛋白，目的蛋白通过亲和层析和分子筛层析获得纯的、有活性的抗体蛋白ScFv。此ScFv抗体与CD3分子有良好的亲和力，可以用于分子检测和临床诊断和疾病。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是一种白细胞抗原结合多肽。

背景技术

抗体在临床药物治疗和临床诊断中占据重要地位,在临床诊断、肿瘤治疗、抗移植排斥、自身免疫性疾病的治疗中得到大规模的应用。随着抗体构建技术的发展，抗体药物先后历经了鼠源抗体(无人源氨基酸序列)、嵌合抗体(60％～70％人源化氨基酸序列)、人源化抗体(90％～95％人源化氨基酸序列)和全人源抗体(100％人源氨基酸序列)等几个阶段。

嵌合抗体使用人源基因代替已有的鼠源单克隆抗体Fc区,因而可保留抗原抗体的特异性,降低HAMA效应。嵌合抗体氨基酸序列中30％左右为鼠源氨基酸序列,因而残留一定的免疫原性,有些能产生很强的HAMA效应。为了降低鼠源成分,研究者在嵌合抗体的基础上,进一步用人源框架区(FR)来代替鼠源框架区(FR),除了3个互补决定区(CDR)是鼠源外,其余都是人源结构,这种进一步人源化的抗体被称为CDR移植抗体或者改型抗体。全人源抗体需要在特定的转基因小鼠中进行或者在人体血液中采集分离特定B细胞，工艺难度较大，目前在国内应用尚不广泛。

CD3仅存在于T细胞表面，由6条肽链组成，常与TCR紧密结合形成含有8条肽链的复合物，在细胞内信息传递中起着重要作用。已有的研究表明抗人T细胞CD3单抗具有激活和抑制T细胞的双重功能，它在抗肿瘤、抗多种器官移植排斥以及再生障碍性贫血的治疗中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白细胞抗原结合多肽，应用基因工程技术设计了一种人源化抗CD3分子的单链抗体并在大肠杆菌中实现高效表达，通过对一种鼠抗CD3抗体的序列分析，通过替换骨架区序列，实现抗体人源化，为了提高蛋白在原核细胞中的翻译表达水平，突变了重链可变区的半胱氨酸残基，构建目的基因的原核表达载体，选取大肠杆菌作为表达宿主，通过高密度发酵，获得融合的，带有纯化标签的融合蛋白，突变后的融合蛋白的表达水平是突变前的5到10倍，融合蛋白通过亲和层析、酶切和分子筛层析获得纯的，有活性的抗体蛋白，此抗体与人免疫T细胞表面CD3分子有良好的亲和力。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种白细胞抗原结合多肽，应用基因工程设计一种人源化抗CD3分子的单链抗体，对一种鼠抗CD3抗体的序列分析，通过替换骨架区序列，实现抗体人源化，通过突变重链可变区的半胱氨酸残基，构建目的基因的原核表达载体，选取表达宿主，发酵，获得融合的、带有纯化标签的融合蛋白，再通过亲和层析、酶切和分子筛层析获得纯化的、有活性的抗体蛋白。

进一步地，所述单链抗体由重链可变区和轻链可变区组成。

进一步地，所述重链可变区蛋白序列包括四个骨架区和三个CDR区，重链可变区的CDR区包括VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，重链可变区蛋白序列为：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSSGGASTSQYGNWYQQTPGKAPKRWIYAGCNRKGPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCGLFSSVIWFFGQGTKLQITR。

进一步地，所述轻链可变区蛋白序列含四个骨架区和三个CDR区，轻链可变区的CDR区包括VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，轻链可变区蛋白序列为：QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTCSYGMVWVRQAPGKGLEWIGGKLRSRSNVSASTYGDTFRDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARHAQFAQSTASSFASWGQGTPVTVSS。