[发明专利]一种群体感应型双向调控系统及其应用

说明书

本发明公开了一种群体感应型双向调控系统及其应用，属于基因工程领域。本发明中的群体感应正调控系统可以自诱导性地上调靶基因，激活倍数达到6.35倍。本发明中的群体感应负调控系统可以自诱导性地下调靶基因，抑制率达到36～96％。本发明筛选得到18种不同强度的群体密度依赖性启动子P_srfAM，其表达强度为天然型P_srfA启动子的0.4–1.5倍。本发明中的群体感应双向动态调控系统可以同时自诱导性地上调和下调不同或相同的靶基因的表达。将筛选得到的群体密度依赖性突变型启动子应用于群体感应型自诱导系统，能更加灵活且自诱导性的调控谷氨酸棒杆菌中目标基因的表达。

技术领域

本发明涉及一种群体感应型双向调控系统及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是公认的一种食品安全级的生产菌株，应用于氨基酸、有机酸、醇类、蛋白质等70余种产品的生物制造，产值超过千亿元。对于谷氨酸棒杆菌，传统的遗传改造策略主要为基因过表达、敲除等，这些手段能一定程度改善菌株的生产性能，但是有一定限度，并且会影响菌株生长，对细胞生长造成负担。近年来，一些合成生物工具逐渐应用于谷氨酸棒杆菌的动态调控和代谢工程改造，如支链氨基酸和甲硫氨酸生物传感器Lrp-P_brnFE，赖氨酸生物传感器LysG-P_lysE，莽草酸生物传感器ShiR-P_shiA等，然而谷氨酸棒杆菌中这类内源性的动态调控元件很有限。因此，寻找新的能够适用于谷氨酸棒杆菌的动态调控元件是很有必要的。

群体感应系统是生物中一种随细胞密度增加而调节基因表达的自诱导系统，它不需要添加外源诱导物，而是利用细胞自身分泌的自诱导物。自诱导物的类型主要有三类：革兰氏阴性菌分泌的高丝氨酸内脂 (AHLs)、革兰氏阳性菌分泌的自诱导肽(AIP)和介导革兰氏阴性菌与阳性菌种间交流的AI-2。来源于一种革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的ComQXPA群体感应系统的自诱导物属于AIP分子类型。该系统由 comX、comQ、comP和comA共4个基因组成，其中comX编码具有55个氨基酸残基的前导肽(Pre-ComX)，该前导肽再经comQ基因的编码产物异戊二烯转移酶ComQ的修饰处理，产生由其C末端10个氨基酸残基组成的、具有活性的类异戊二烯类多肽信息素ComX。随着细菌的生长和群体密度的增加，释放到胞外的信息素分子ComX不断积累。当达到一定阈值时，信息素ComX就与跨膜蛋白组氨酸激酶ComP结合，并激活该酶，促进其发生自磷酸化。磷酸化的ComP随后将磷酸基团转移给ComA调控蛋白，并激活该蛋白。被激活的ComA蛋白进而结合在下游靶基因的启动子上并激活下游靶基因的表达，而P_srfA是ComQXPA 系统的靶启动子之一。

小分子调控RNA(small regulatory RNA，sRNA)是一类序列长度为50-200个核苷酸的非编码RNA，主要作为调控因子维持翻译和信息传递稳定。其中一类sRNA形成二级结构招募RNA分子伴侣Hfq，通过碱基配对方式靶向mRNA，促进sRNA与mRNA之间杂交，抑制翻译。同时，Hfq招募核糖核酸酶E (RNAseE)加速mRNA降解。因此，hfq-sRNA系统可以抑制基因表达。马延和等研究者将hfq-sRNA系统引入到谷氨酸棒杆菌中，负调控绿色荧光蛋白基因gfp的表达，其抑制率为86.7％，将该系统进一步应用于谷氨酸合成途径中其他基因的抑制调控，提高了代谢产物谷氨酸的产量。将hfq-sRNA系统与群体感应系统相偶联，从而开发一套适用于谷氨酸棒杆菌的自诱导性下调系统，将会更好地服务于谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造。

将群体感应系统运用于代谢工程，无需添加诱导物就可以自动调节基因表达，是一种经济且较理想的技术手段。目前文献报道中已有多种群体感应系统被开发出来并应用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等的代谢工程调控。然而在谷氨酸棒杆菌中群体感应调控元件的开发和应用仍然处于空白。因此，改造异源的群体感应自诱导系统并将其引入谷氨酸棒杆菌中是一个很好的基因回路改造策略，能够丰富谷氨酸棒杆菌的动态调控元件类型，并促进谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造。因此，如何获得谷氨酸棒杆菌可用的、有效的群体感应自诱导工具、实现基因表达的自动动态调控仍然是一个重要的技术问题。