[发明专利]农杆菌介导的红椿遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

以红椿的叶片为外植体，所述外植体经预培养之后再用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染；预培养的时长为1d～3d，预培养的培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L 6-BA、0.8mg/L～1.2mg/L KT、0.03 mg/L～0.06mg/L NAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂的MS培养基，预培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃；所述植物表达载体为pCAMBIA1305.2；所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105；所述菌液的OD600为0.4～0.8；所述菌液中含有45mmol/L～155mmol/L乙酰丁香酮，侵染之前，对所述外植体进行超声波处理，超声波处理的时长为25s～35s，超声波处理的功率为4.5kHz～5.5kHz；

将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基，共培养；所述共培养培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L 6-BA、0.8mg/L～1.2mg/L KT、0.03 mg/L～0.06mg/L NAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂和145mmol/L～155mmol/L乙酰丁香酮的MS培养基，共培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃，时长为22h～26h；

对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定芽的诱导培养、芽的诱导培养以及根的诱导培养；对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，所述愈伤组织的诱导培养采用T1培养基，所述T1培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L 6-BA、0.8mg/L～1.2mg/L KT、0.03 mg/L～0.06mg/L NAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂和90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠的MS培养基；所述不定芽的诱导培养采用T2培养基，所述T2培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L 6-BA、0.8mg/L～1.2mg/L KT、0.03 mg/L～0.06mg/LNAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂、90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠和9mg/L～11mg/L卡那霉素的MS培养基；所述芽的诱导培养采用T3培养基，所述T3培养基为含0.25mg/L～0.35mg/L 6-BA、0.18mg/L～0.22mg/L NAA 、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂、90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠和9mg/L～11mg/L卡那霉素的MS培养基；所述根的诱导培养采用T4培养基，所述T4培养基为含0.08mg/L～0.12mg/L NAA、13g/L～17g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂、90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠和9mg/L～11mg/L卡那霉素的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述菌液中含有50mmol/L的乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有150mmol/L的乙酰丁香酮。

3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述共培养培养基为含3mg/L 6-BA、1mg/L KT、0.05mg/L NAA、30g/L蔗糖、5g/L琼脂和150mmol/L乙酰丁香酮的MS培养基。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，共培养的条件包括：避光，温度为25℃，时长为24h。