[发明专利]一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法

权利要求书

1.一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：其步骤如下：

1）蛋白质提取：将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子及其母本种子压扁，每粒种子加纯水35μl~40μl，100℃水浴5分钟后，放置半小时，获得提取液用于上样；

2）凝胶制备：采用水平灌胶的方式组装玻璃板，分离胶灌至离后玻璃板顶部3~4cm处，轻轻加一层蒸馏水覆盖静置30min以上；浓缩胶灌胶至玻璃板顶端，插好点样梳，浓缩胶凝固后拔出点样梳；

3）点样：每粒种子取25μl提取液上样；

4）电泳：步骤3）上样完毕后，用电极缓冲液封样，然后将电泳槽注满电极缓冲液，滴加溴酚蓝作指示剂，4-15℃条件下，每电泳槽20-40mA稳流电泳；30min后，调电流至50-70mA继续稳流电泳，待指示剂至凝胶底部时结束电泳；

5）卸板、染色：电泳结束后，取出胶板，将分离胶转移至染色液中染色30-40min后，置于观片灯上读带；

6）纯度计算：对比甘蓝型油菜杂交种及其母本水溶蛋白谱带的差异，统计制种样中具有母本水溶蛋白电泳谱带类型的个体数量；根据纯度计算公式计算出甘蓝型油菜杂交种种子纯度，所述纯度计算公式为：

水溶蛋白鉴定种子纯度=（1-母本带型数量/总检测种子数量）×100％。

2.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤1）中所述用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子及其母本种子的选取采取四分法取样，具体为，将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子晃动均匀，取出9-11g，放在纸上，剔除瘪粒及霉、烂种子，采用四分法取样。

3.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤1）中所述用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子为“沣油520”甘蓝型油菜杂交种种子。

4.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤2）中所述分离胶为：300g丙烯酰胺，8g亚甲基双丙烯酰胺，ddH₂O定容至1000ml，4℃保存。

5.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤2）中所述浓缩胶为：100g丙烯酰胺，25g亚甲基双丙烯酰胺，ddH₂O定容至1000ml, 4℃保存。

6.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤4）中所述电极缓冲液为：360g三羟甲基氨基甲烷Tris，480ml 1mol/L的HCl， 4.6ml四甲基乙二胺TEMED，用 ddH₂O定容至1000ml, 4℃保存。

7.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤5）中所述染色液为：12.5g三氯乙酸,30ml甲醇，27ml乙醇，10ml冰乙酸，0.015g考马斯亮蓝R-250，0.045g考马斯亮蓝G-250，ddH₂O定容至100ml，避光保存。

8.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：步骤4）中所述溴酚蓝指示剂的用量为1滴0.2%溴酚蓝。

9.如权利要求1所述的水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其特征在于：还包括 纯度验证步骤，所述纯度验证具体步骤如下：

将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子的制种样同时进行种植鉴定和醇溶蛋白鉴定，其中种植鉴定利用盛花期育性表现调查纯度，纯度计算公式为：种植鉴定种子纯度=（1-不育株数/总调查株数）×100％；醇溶蛋白鉴定利用杂交种与母本醇溶蛋白谱带的差异，纯度计算公式为：醇溶蛋白鉴定种子纯度=（1-母本带型数量/总检测种子数量）×100％；分析三种方法的鉴定结果，验证该方法进行纯度鉴定的准确性。