[发明专利]一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法有效
| 申请号： | 202110444930.6 | 申请日： | 2021-04-24 |
| 公开（公告）号： | CN113073076B | 公开（公告）日： | 2022-09-09 |
| 发明（设计）人： | 蔡子文;王月;董念国;徐力;乔韡华;史嘉玮;张冬卉;曹红;周庭文;谢明辉;朱苗苗 | 申请（专利权）人： | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077;C12N5/071 |
| 代理公司： | 武汉信合红谷知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42264 | 代理人： | 蒋明 |
| 地址： | 430022 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 多能 干细胞 化为 瓣膜 内皮 细胞 间质 分化 方法 | ||
1.一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:准备用于分化的培养瓶或培养皿；
S2:准备iPSCs：iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液，离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数；
S3:D0接种细胞：将iPSCs接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿内，用含10μMY27632的mTeSR1培养，水平十字摇匀，放于培养箱中培养；
S4:D1-D4分化：将培养基更换成含有6-8μM CHIR99021和25ng/mL BMP4的N2B27培养基，3天不换液；
S5:D5-D6分化：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μMForskolin的Stempro-34培养基，每天换液；
S6:CD144阳性细胞磁珠分选：在分化满6天后用CD144阳性的磁珠进行分选，分选阳性细胞即为瓣膜内皮细胞分选阴性细胞即为瓣膜间质细胞；
S7:瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞的培养与传代：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。
2.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S2具体为：将iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部按照1:100的比例铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液并轻柔吹打下细胞，1000rpm离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数。
3.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S3具体为：将iPSCs以4w-6w/cm2的密度接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿，用含10μMY27632的mTeSR1培养，每T25培养瓶4mL培养基，水平十字摇匀，放于培养箱中培养1天。
4.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S4具体为：将培养基更换成含有6-8μM CHIR99021和25ng/mLBMP4的N2B27培养基，每T25培养瓶15-17mL培养基，3天不换液。
5.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S5具体为：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μMForskolin的Stempro-34培养基，每T25培养瓶10-12mL培养基，每天换液。
6.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S7具体为：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别以100w/cm2和75w/cm2的密度接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。
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