[发明专利]一种产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及代谢工程技术领域，具体涉及一种产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用。本发明构建的产唾液酸乳糖的重组宿主菌过表达pyrG基因和/或串联过表达一个或多个拷贝数的cmk和ppk基因。本发明通过辅因子CTP的再生或者过表达CTP合成酶基因提高细胞内的底物辅因子的供应，无需外源性的添加辅因子，降低生产成本，并且还可以利用不同拷贝数的表达载体串联表达cmk和ppk基因，优化底物CTP含量，实现唾液酸乳糖产量的提高。

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，尤其是涉及一种产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用。

背景技术

人乳寡糖（HMOs）是人类母乳中仅次于乳糖和脂肪的第3大固体组分，不仅种类多，且含量较高，特别是在分娩后的初乳中，有着牛乳、羊乳等其他动物的母乳远所不如的寡糖含量。现已证实，HMOs具有效益生元作用，可以选择性刺激肠道内有益菌的生长，间接抑制有害菌的生长，维持肠道微生态平衡，从而最大限度地降低消化道疾病的发生，进而改善宿主婴儿的健康状况，这种循序渐进、立体和全方位的保护兼培养性功能，为新生儿消化系统的发育和成熟提供了宝贵的时间和良好的环境。唾液酸寡糖就是含有一个或若干个唾液酸分子的一类寡糖化合物，广泛分布在各种生物组织中，具有重要的生物信息传递等功能。同时作为HMOs中最主要的两种寡糖组成之一，唾液酸寡糖也表现出了独特的生理活性和优越的市场潜力。HMOs中唾液酸寡糖的主要存在形式有两种：3’-SL和6’-SL，他们分别由α-2,3和α-2,6唾液酸糖基转移酶催化一分子唾液酸和一分子乳糖脱水缩合而成。

目前关于发酵法制备唾液酸乳糖，国内外已有相关专利和文献公布。根据发酵底物的不同，主要分为补救路径和从头合成路径。在补救路径中是以唾液酸和乳糖为合成底物制备唾液酸乳糖，2002年Eric Samain使用补救合成路径，以E.coli JM107为宿主，敲除NeuAc醛缩酶基因（ nanA）和β-半乳糖苷酶基因（ lacZ）,过表达CMP-NeuAc合成酶和唾液酸转移酶，以唾液酸和乳糖为合成底物，甘油为碳源进行发酵，可生成2.6g/L 3’-唾液酸乳糖。2008年Eric Samain以从头合成路径制备3’-唾液酸乳糖（图2），通过敲除NeuAc转运子（ nanT），NeuAc醛缩酶基因（ nanA），N-乙酰甘露糖胺激酶基因（ nanK），N-乙酰甘露糖胺-6-6磷酸差向异构酶基因（ nanE），过表达乙酰神经氨酸合成酶基因（ neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（ neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（ neuC）以及a-2,3-唾液酸转移酶，以乳糖为合成底物，甘油作为碳源发酵制备3’-唾液酸乳糖，可生成25.5g/L 3’-唾液酸乳糖。2010年Eric Samain课题组同样以从头合成构建6’-唾液酸乳糖路径，仅将3’-唾液酸乳糖从头合成路径中的a-2,3-唾液酸转移酶更改为a-2,6-唾液酸转移酶，发酵获得34g/L 6’-唾液酸乳糖。