[发明专利]基于MSC的基因重组细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S101：把IL-35EBI3、IL-35IL12A、IL-22、FGF1的编码基因分别克隆到一个带有跨膜区结构的真核表达载体pDisplay中，形成IL-35EBI3、IL-35IL12A、IL-22、FGF1细胞膜表面展示质粒pD-IL35EBI3、pD-IL35IL12A、pD-IL22、pD-FGF1；

S102：制备hUC-MSC细胞；

S103：把步骤S101所述的pD-IL35EBI3、pD-IL35IL12A、pD-IL22、pD-FGF1质粒等量混合转染进步骤S102所述的hUC-MSC细胞，产生MSCd12235细胞；

所述MSCd12235细胞膜表面展示有pD-IL35EBI3、pD-IL35IL12A、pD-IL22、pD-FGF1蛋白。

2.根据权利要求1所述的基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，在所述的S101中，包括：

S1011：构建IL-35EBI3、IL-35IL12A膜表面展示质粒pD-IL35EBI3、pD-IL35IL12A；

S1012：构建IL-22膜表面展示质粒pD-IL22；

S1013：构建FGF1膜表面展示质粒pD-FGF1。

3.根据权利要求2所述的基于MSC的基因重组细胞的制备方法，其特征在于，在所述的S1011中，包括：

S10111：引物设计

1）引物1 IL35EBI3upSacII: GACGTCCCGCGGatgaccccgcagcttctcctg；

2）引物2 IL35EBI3dnSalI: GACGTCGTCGACcttgcccaggctcattgtggca；

3）引物3 IL35IL12AupBglII: GACGTCAGATCTatggtcagcgttccaacagcc；

4）引物4 IL35IL12AdnSalI: GACGTCGTCGACggcggagctcagatagcccat；

S10112：制备RNA：采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞PBMC，再用TRIzol试剂制备总RNA；

S10113：RT- PCR：

1) 以总RNA为模版，引物1和引物２为引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备IL35EBI3基因片段，用EZ Spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；

2) 以总RNA为模版，引物３和引物４为引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备IL35IL12A基因片段，用EZ spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；

S10114：限制性内切酶消化pDisplay载体及PCR产物

1) 分别用SacI/SalI及BglII/SalI限制性内切酶消化pDisplay载体，用EZ-10 SpinColumn DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pDisplay SacII/SalI及pDisplayBglII/SalI 2个酶切载体产物；

2) 分别用SacII/SalI限制性内切酶消化IL35EBI3基因片段，用BglII/SalI限制性内切酶消化IL35IL12A基因片段，用EZ-10 Spin Column DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得IL35EBI3基因SacII/SalI片段及IL35IL12A基因BglII/SalI片段2个酶切基因产物；

S10115：连接

1）用DNA连接酶连接pDisplay SacII/SalI及IL35EBI3基因SacII/CalI片段，获得pD-IL35EBI3产物；

2）用DNA连接酶连接pDisplay BglII/SalI及IL35IL12A基因BglII/SalI片段，获得pD-IL35IL12A产物；

S10116：转染感受态菌：

用pD-IL35EBI3产物及pD-IL35IL12A产物分别转染DH5α感受态细菌；

S10117：挑菌落及验证：

挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，分别用SacI/SalI及BglII/SalI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认；保存pD-IL35EBI3及pD-IL35IL12A重组菌；

S10118：培养pD-IL35EBI3及pD-IL35IL12A重组菌，制备pD-IL35EBI3及pD-IL35IL12A重组质粒。