[发明专利]用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化

权利要求书

1.一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，其包括：

(a)包含Cas9切口酶的蛋白质或者编码所述蛋白质的多核苷酸，所述Cas9切口酶包含在催化结构域中的至少一个突变并且缺乏切割一条DNA链的能力，其中所述Cas9切口酶连接至至少两个核定位信号(NLS)；

(b)CRISPR-Cas系统嵌合指导序列，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并指导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和长度为至少30个核苷酸的tracr序列。

2.一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas载体系统，其包括一个或多个载体，所述载体包含：

(a)可操作地连接至编码包含Cas9切口酶的蛋白质的核苷酸序列的第一调节元件，所述Cas9切口酶包含在催化结构域中的至少一个突变并且缺乏切割一条DNA链的能力，其中所述Cas9切口酶连接至至少两个核定位信号(NLS)；

(b)可操作地连接至编码CRISPR-Cas系统嵌合指导序列的核苷酸序列的第二调节元件，所述CRISPR-Cas系统嵌合指导序列包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并指导CRISPR-Cas复合物与所述靶序列序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和长度为至少30个核苷酸的tracr序列；

其中组分(a)和(b)位于所述系统的相同或不同载体上。

3.根据权利要求2所述的系统，其中所述载体是病毒载体。

4.根据权利要求3所述的系统，其中所述病毒载体是腺相关载体。

5.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少40个核苷酸。

6.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少50个核苷酸。

7.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述指导序列的长度为15-30个核苷酸。

8.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述指导序列的长度为至少20个核苷酸。

9.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述Cas9包含RuvC结构域中的至少一个突变。

10.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述Cas9包含与化脓链球菌Cas9的D10A，H840A，N854A或N863A相对应的突变。

11.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述Cas9是化脓链球菌Cas9，且PAM是NGG；或者其中所述Cas9是嗜热链球菌Cas9，且PAM是NAGAAW。

12.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述蛋白质包含连接至所述Cas9的至少一个异源蛋白结构域。

13.根据权利要求12所述的系统，其中所述异源蛋白结构域具有以下活性中的一种或多种：甲基酶活性，脱甲基酶活性，转录激活活性，转录抑制活性，转录释放因子活性，组蛋白修饰活性，RNA切割活性和核酸结合活性。

14.根据权利要求12所述的系统，其中所述异源蛋白结构域是GFP。

15.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述蛋白质包含连接至所述Cas9的至少一个SV40病毒大T抗原NLS(PKKKRKV)。

16.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述蛋白质包含至少一个N末端NLS和至少一个C末端NLS。