[发明专利]一种高效表达藤壶粘胶蛋白的酵母工程菌及其制备方法

权利要求书

1.表达载体，其特征在于，包括如下任意一种：

i)pAOαN-4Mrcp19k载体，序列如SEQ ID NO.1所示；

ii)pAOαN-4Mrcp20k载体，序列如SEQ ID NO.2所示；

iii)pAOαN-4proROL-Mrcp19k载体，序列如SEQ ID NO.3所示；

iv)pAOαN-4proROL-Mrcp20k载体，序列如SEQ ID NO.4所示。

2.载体组合，其特征在于，由权利要求1所述的载体与pPICZ-Ssa4-VHb和pPIC3.5k-Sso2-Bmh2载体组合而成；

其中，pPICZ-Ssa4-VHb序列如SEQ ID NO.5所示；pPIC3.5k-Sso2-Bmh2载体序列如SEQID NO.6所示。

3.酵母工程菌，其特征在于，含有权利要求1所述的表达载体或权利要求2所述的载体组合。

4.如权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母菌株为毕赤酵母GS115。

5.如权利要求3至权利要求4任一项所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母工程菌以保藏编号CCTCC M 2021265或CCTCC M 2021266保藏于中国典型培养物保藏中心。

6.利用权利要求3至权利要求5任意一项所述的酵母工程菌表达粘胶蛋白的方法，其特征在于，菌液培养时BMGY培养基初始pH＝7.0，接种量为3％(v/v)，诱导物甲醇添加量为1.5％(v/v)，诱导时间96h，诱导温度25℃。

7.如权利要求6的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的表达载体或权利要求2所述的载体组合转化毕赤酵母感受态细胞，得到含有上述表达载体或载体组合的酵母重组基因工程菌；

(2)将步骤(1)得到的酵母重组基因工程菌接种于5mL YPD液体培养基中，培养20h；

(3)工程菌以3％(v/v)的接种量接种于50mL初始pH＝7.0的BMGY培养基中28℃培养24h；

(4)离心收集菌体并接种于50mL BMMY培养基中，每隔24h添加诱导物无水甲醇至甲醇终体积浓度为1.5％(v/v)，200rpm/min摇床上，25℃诱导表达96h。