[发明专利]一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法

说明书

本发明涉及一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法，包括以下步骤；步骤一、尿液收集及尿液原代细胞的获取；步骤二、逆转录病毒的包装；步骤三、尿液细胞的感染；步骤四、尿液细胞的诱导；步骤五、克隆细胞挑出；步骤六、尿源iPSC鉴定。采用本发明的方法能够去除繁琐且不可控的小鼠胚胎成纤维细胞制备，改用商品化的基质胶，减少了工艺环节、降低了实验难度，同时采用小分子两阶段诱导方法，缩短诱导时间。

技术领域

本发明涉及一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法。

背景技术

现有技术(T Z,C B,S D,et al.Generation of human induced pluripotentstem cells from urine samples.Nature protocols.2012；7(12):2080-2089.)中获取尿源诱导多能干细胞的主要步骤分为：1.尿液收集及尿液原代细胞的获取；2.逆转录病毒的包装及尿液原代细胞的感染；3.感染后的尿液原代细胞转至小鼠胚胎成纤维细胞上继续诱导。其中，第3步中所要用到的小鼠胚胎成纤维细胞的制备需要取怀孕13.5天的CF-1小鼠的胎鼠的躯干制备成原代细胞后再通过γ射线照射或丝裂霉素C处理，处理过程中需要摸索γ射线照射的强度及时间长度或丝裂霉素C的浓度，条件难以把控，过程较为复杂，同时在诱导过程中引物小鼠来源的细胞，也降低了诱导多能干细胞的安全性。本发明中使用的方案通过改善方案中第3步诱导过程，去除繁琐且不可控的小鼠胚胎成纤维细胞制备，改用商品化的基质胶，减少了工艺环节、降低了实验难度，同时采用小分子两阶段诱导方法，缩短了诱导时间。

发明内容

本发明提供了以下技术方案：

一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法，包括以下步骤；

步骤一、尿液收集及尿液原代细胞的获取；

步骤二、逆转录病毒的包装；

步骤三、尿液细胞的感染；

步骤四、尿液细胞的诱导；

步骤五、克隆细胞挑出；

步骤六、尿源iPSC鉴定。

优选的，步骤三中，包括制备预先基质胶包被，具体步骤为：处理和分装基质胶；使用时拿出分装的基质胶用预冷的杜氏改良伊格尔培养基/汉氏F-12营养培养基按照1：100稀释后均匀铺到培养皿中，100mm培养皿8ml/皿，6孔板1ml/孔，12孔板500ul/孔；室温下孵育至少1小时或37℃孵育至少30分钟，使用前吸出剩余基质胶稀释液。

优选的，步骤三中包括步骤3.1：在6孔板的每个孔内铺60000个尿液细胞；接种24小时后观察尿液细胞汇合度约为30％，移去培养基加2ml新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基；随后每孔加入第二步第4条中第一次收集的四因子的病毒上清共8ml；在37℃，95％CO2坏境中培养。

优选的，步骤三中包括步骤3.2：12-16小时后，移去培养基，每孔加2ml新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基让细胞恢复；8-12小时后，每孔加入第二步第4条中第二次收集的四因子的病毒上清共8ml，第二次感染；在37℃，95％CO2坏境中培养。

优选的，步骤三中包括步骤3.3：二次感染12小时后，移去培养基加2ml新的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基；继续培养，每天更换新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。

优选的，步骤三中包括步骤3.4：每天显微镜观察被感染的尿液细胞。