[发明专利]一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法

说明书

本发明提供了一种高效获取脂肪组织单细胞的方法。由于临床脂肪样本的获取属于有创性操作，大小和重量均有限，单细胞得率和活性较低。本发明提出的消化方法通过化学和物理方法相结合，对脂肪组织分次酶解后进行手工柔和研磨，而后进行流式分选，能够有效提高脂肪组织的单细胞得率，且保证单细胞活率，尤其适用于少量脂肪组织如心包脂肪、血管旁脂肪、眼周脂肪等单细胞提取，便于细胞治疗的进一步开展。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法。

背景技术:

脂肪组织是一种复杂的器官，具有多种的生理功能。研究认为正常脂肪组织的积累对人体具有重要的保护和缓冲作用，可供给人体热量，构成生物活性物质，以及调节生理机能。贮存的脂肪在一些情况下可以分解成脂肪酸，其具有降血压，降血脂，抗衰老等作用。但脂肪过多也会导致各种心血管疾病和代谢并发症。最新研究认为脂肪可能是一种重要的免疫器官，其包括多种细胞类型，如脂肪细胞，前成脂肪细胞，内皮细胞，成纤维细胞，干细胞，以及不同的免疫细胞。其中，含有的免疫细胞包括T细胞，B细胞，中性粒细胞，巨噬细胞，NK细胞。另外，从脂肪组织中可以分离得到的具有多向分化潜能的干细胞，即脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，因具有低免疫原性和多向分化潜能等特点，是再生医学中极为重要的细胞之一，在细胞治疗领域具有广泛的应用前景。

脂肪分布于人体的各个部位，不同部位的脂肪可能发挥着不同的作用(Rosen ED,Spiegelman BM.WhatWe TalkAbout When We TalkAbout Fat[J].Cell,156(1-2):20-44)。因此，越来越多的研究尝试探索不同部位脂肪组织中细胞亚群的种类和数量，以及不同部位来源的脂肪组织中不同细胞的功能。近年发展的单细胞测序技术是研究细胞异质性，鉴定细胞类型，分子调控网络，细胞间相互作用等的强有力的技术手段。然而单细胞测序样本的制备要求较高，通常要求细胞浓度较高(300～600个细胞/uL)，活率在90％左右。然而通过应用现有的脂肪组织消化方法，脂肪样本可获得的细胞数量较低，尤其是针对一些较难获取的，数量较少的脂肪组织，如心包脂肪，血管旁脂肪，眼周脂肪等，脂肪组织消化的不充分，导致获取的细胞数量及活率无法满足下游研究和分析的需求，其用于疾病治疗的可能也受限。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效获取脂肪组织中单细胞的方法，尤其适用于较难获取的脂肪样本的细胞提取，如心包脂肪，血管旁脂肪，眼周脂肪等，在保证细胞活率的前提下提高了单细胞得率，特别是免疫细胞和干细胞的得率。

根据本发明所要解决的技术问题，本发明的内容包括如下步骤。

1)将获取的脂肪组织清洗后剪碎，加入1～2倍体积的消化酶进行消化；

2)第一次消化结束后对步骤1)所得的组织悬液进行离心，抽取下层消化液和细胞的混悬液，加入等体积的终止液中和消化酶的作用，得到悬液A，上层未消化的组织块继续加入1～2倍体积的消化酶对组织块进行第二次的消化；

3)在第二次消化后，将未完全消化的组织块，第二次消化所得的消化液和细胞的混悬液，以及悬液A，全部加入放置了细胞筛网的培养皿中，进行手工柔和研磨，吸取研磨后的细胞悬液，加入等体积的终止液中和消化酶的作用，得到悬液B；

4)为提高细胞得率，用平衡液多次轻柔冲洗研磨后的细胞筛网，冲洗后的液体加入悬液B，得到悬液C；

5)将悬液C离心后得到的细胞团块使用平衡液重悬，过细胞筛网，得到的悬液D，即为所需细胞悬液。

6)将步骤5)所得的细胞悬液通过流式分选出所需单细胞，用于后续检测及实验。

进一步地，步骤1)～3)中的消化酶为DMEM配制的，质量体积分数为0.1％的胶原酶I。