[发明专利]纤维素色谱纯化RNA的方法

说明书

本发明提供富集单链RNA的方法和组合物。

技术领域

本发明涉及纯化RNA的方法，具体涉及单链RNA的快速纯化方法。

背景技术

mRNA疗法以mRNA为制剂治疗疾病，是一种新兴的基因疗法，既可通过功能性蛋白的表达治疗基因缺陷性疾病或组织修复，又可通过抗原或抗体或受体的表达应用于免疫治疗，具有极大的应用价值。mRNA是一种单链RNA(ssRNA)，其需要依赖可重复的，高效率的ssRNA的生产纯化去除生产过程中的反应物和副产物，才能应用于医疗用途。众所周知，ssRNA生产基于依赖DNA的RNA聚合酶转录合成，在生产过程中产生的RNA往往是不纯的RNA混合物。转录合成产物中不仅含有NTP，T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、RNase Inhibitor(核糖核酸酶抑制剂)等，还包括流产转录本、转录终止产物等截短RNA副产物，冗余转录副产物；此外，依赖于RNA模板的非特异性RNA聚合酶活性还可能带来dsRNA(双链RNA)副产物。mRNA的生产还包括ssRNA的5’UTR加帽酶修饰、5’UTR甲基转移酶修饰、3’UTR的polyA修饰反应步骤，这些反应产物步骤中也包括各种酶蛋白、NTP底物等需要纯化去除。

通常情况下，传统的琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳、酚氯仿抽提、LiCl沉淀、乙醇或异丙醇沉淀、基于硅胶的商业化RNA纯化试剂盒方法，可以以不同效率去除反应产物中的游离核苷酸，蛋白质，盐和短RNA寡核苷酸，但无法实现生产的可重复和规模化放大及高效率生产。现有研究表明只有通过色谱纯化提高mRNA纯度，降低转录合成mRNA中副产物引起的免疫激活及其它副反应，才能大幅度提高mRNA的可翻译效率。

研究表明高效液相色谱可实现高效，可扩展的纯化生产毫克到克级别的药用RNA。目前已报道的mRNA或其它长链ssRNA的样品制备相关色谱分离技术包括反相离子对色谱(RP-IP)，离子交换色谱(IE)，亲和色谱(AC)，分子筛(SEC)等。McKenna SA等报道采用凝胶过滤分子筛的方法从转录化合物中纯化120-400nt的长链RNA的色谱纯化方法，这种方法只能分离短片段ssRNA，随着ssRNA长度的增加其分离效果会显著下降。Weissman D和Nwokeoji AO分别报道了用离子对反向高效液相色谱方法分离ssRNA、dsRNA、不完全配对dsRNA的案例，但是该方法中反相色谱填料的相对载量有限，不利于RNA纯化工艺的放大，色谱分离缓冲液中的某些有机物有一定的毒性也影响到其生产应用。Keel AY，Di Tomasso G等报道了利用MS2和ARiBO RNA配体亲和层析纯化RNA的案例，这些方法需要在治疗RNA序列中添加RNA配体序列，这可能会影响治疗性目标RNA的治疗性功能效率。离子交换(IEX)HPLC纯化方法的缺点是目前已公开文献中多数针对数百个碱基的长链RNA纯化，而大于1000nt的更长RNA纯化则需要在变性和/或碱性的流动相条件下才能实现，这使得RNA存在不稳定的风险，容易出现沉淀或降解等现象，产品回收率低。

除了上述HPLC纯化方法外，还有一种方法是通过纤维素色谱特异性吸附RNA纯化。早在上世纪90年代Maran A和Mellits KH就报道了使用纤维素分离ssRNA和dsRNA的方法。此后相继有其它文献报道了使用纤维素色谱纯化分离RNA的方法。这些文献均采用乙醇作为流动相纯化分离ssRNA。例如，CN109072232A公开了用于提供单链RNA的方法，在RNA阳性纯化工艺中，结合缓冲液乙醇浓度范围为大于35％，优选38％-42％；盐浓度15-70mM，最优是20-60mM。上述基于纤维素的纯化方法的缺点是RNA在纤维素色谱纯化之前都需要进行预处理离心沉淀分离，该预处理步骤明显不利于工艺的规模放大。

本领域仍需一种步骤简化、利于放大的RNA提取工艺。

发明内容

发明人研究了在不同有机溶剂和盐浓度下的样品预处理方式，以及在不同预处理方式下RNA色谱纯化的效率，开发了无需离心沉淀的样品预处理步骤而可以直接进行纤维素色谱纯化的溶剂和方法。