[发明专利]TREM2蛋白抗体包被磁珠在提取血清中小胶质细胞来源外泌体的应用

说明书

本发明公开了一种TREM2蛋白抗体包被磁珠在提取血清中小胶质细胞来源外泌体的应用，用小胶质细胞特异性蛋白TREM2蛋白的抗体包被磁珠，通过磁珠免疫法提取血清中外泌体，经免疫荧光印迹、透射电镜成像和粒径分析进行验证，证明了TREM2蛋白抗体包被的磁珠能够有效提取血清中小胶质细胞来源外泌体。

技术领域

本发明涉及生物医药工程领域，具体涉及TREM2蛋白抗体包被磁珠在提取血清中小胶质细胞来源外泌体的应用。

背景技术

阿尔茨海默病是最常见的中枢神经退行性疾病，表现为持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白沉积、神经原纤维缠结、大量记忆性神经元数目减少以及老年斑的形成。该病主要发生在老年期及老年前期，目前全球至少有5000 万以上患者，在中国约有1000万患者，而当今社会老龄化程度的加快为诊断和治疗带来新的压力和挑战。

阿尔茨海默病起病隐潜、发展缓慢，最早期往往是以逐渐加重的健忘开始，如果不注意，通常不容易发现，按照病情的发展可大致分为三个阶段，并且目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的药物，因此早期的诊断和干预显得尤为重要，这对于延缓疾病进程和保持患者生存质量具有重要意义。随着对AD中Aβ和Tau蛋白认识的深入，大量的临床和实验研究发现：在临床出现极轻微症状之前的“AD临床前期”(preclinical AD)阶段，AD的病理学损害表现(Aβ沉积，Tau蛋白过磷酸化，以及继发的炎性损害、氧自由基、兴奋毒等)就已经在患者的脑内持续进展。但是，目前阿尔茨海默病的诊断主要依靠脑神经病理学检查、神经影像学检查(包括磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、淀粉样蛋白PET)和脑脊液检测，但这些方法存在费用高昂、影像检查和穿刺造成身体损伤和疼痛等问题，使得患者在产生明显症状前不愿主动采用此类方式进行检查，从而错过了最佳干预时期。目前本领域尚缺乏一种符合有效性、费用低、对身体损伤小这些要求的诊断方法，因此本领域迫切需要寻找和开发新的检查策略。

小胶质细胞是大脑中固有的免疫效应细胞，通过细胞与细胞间的直接相互作用或者营养因子的间接分泌，在调节脑损伤细胞死亡和神经行为恢复中发挥关键作用。而外泌体是一种包含了丰富核酸、蛋白质的膜泡，经内体膜和细胞膜融合运送，直径介于30-150nm之间，能够穿过血脑屏障(BBB)，循环外泌体存在于各种体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，可将生物活性物质递送至受体细胞以调节细胞功能，在介导细胞间通讯中起重要作用。

这提示我们是否可以通过提取血清中小胶质细胞来源外泌体，检测外泌体中一些AD相关蛋白例如CD33、TREM2等以及特征miRNA的表达和含量，来间接反映小胶质细胞的生理或病理状况，从而为我们提供阿尔茨海默病早期病理学损害的依据。而且，获取患者血清通过简单的抽血就可以实现，符合费用低和对身体损伤小的要求，有助于实现临床早期干预，定期血检也可以用来监控阿尔茨海默病患者的疾病进程，最终提高预防和治疗水平，改善患者生活质量。但目前本领域尚没有提取血清中小胶质细胞来源外泌体的方法，TREM2蛋白是单次跨膜的超免疫球蛋白，其最初在单核细胞衍生的树突细胞和小鼠巨噬细胞中被鉴定，而在大脑中，TREM2蛋白仅由小胶质细胞产生，这提示我们TREM2蛋白是否可以作为提取小胶质细胞来源外泌体的关键蛋白，并以此为切入点进行我们的方法设计。

发明内容

本发明的目的是基于以上问题的诉求，发现一种提取血清中小胶质细胞来源外泌体的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案实现的：首先是对血清进行超速离心获取血清中总外泌体。然后用小胶质细胞特异性跨膜蛋白TERM2的抗体包被磁珠，通过磁珠特异性捕捉法实现对小胶质细胞来源外泌体的特异性富集。最后对提取的血清中小胶质细胞来源外泌体进行鉴定，鉴定方法为蛋白免疫印迹法(western blot)、透射电镜分析和粒径分析。