[发明专利]重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法及应用

说明书

本发明公开了一种重组表达质粒构建透明质酸工程菌株及使用方法，属于生物活性物质提取技术领域，其特征在于重组表达质粒包含一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；通过发酵制备高分子透明质酸发酵液，包括破壁工序、分离工序、提取工序和水解工序，本发明的有益效果是：几丁质酶进行破壁处理，利用产蛋白酶将糖蛋白变性水解后与透明质酸脱离；而分离后的透明质酸能够顺利通过细胞膜到细胞膜外，达到了将糖蛋白变性后与透明质酸分离的目的，规避了因内容物释放导致透明质酸酶水解效率差和杂质难以处理的问题，保证了低分子透明质酸高收率和低蛋白杂质。

技术领域：

本发明属于生物活性物质提取技术领域，更具体地涉及一种重组表达质粒构建透明质酸工程菌株及使用方法。

背景技术：

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又称为玻尿酸，是一种以D-葡萄糖醛酸(Glca)和N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAC)为双糖单位聚合而成的酸性粘多糖。广泛存在于动物和人体的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10 ⁵-10 ⁷Da。寡聚透明质酸是指分子量小于 10kDa的透明质酸。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，但是对分子的渗透性影响很大，因此小分子透明质酸在生物渗透，生物降解方面具有独特的特性，极具应用价值。

透明质酸的制备方法主要有动物组织提取法和微生物发酵法，但得到透明质酸分子量一般在0.8-1.5×10⁶Da，要得到更小分子量的透明质酸必须经过水解，一般水解方法有三种：物理法、化学法和酶法，但这些方法水解过程都是随机性的，水解产物的分子量分布较广，直接使用就会影响产品功效，要得到分子量分布窄的低分子量透明质酸就必须再次经过分步提纯法才能获得，但这就增加了生产成本，也影响产品收率。

现在有较多的专利和文献报道透明质酸的制备方法，在制备小分子或寡聚透明质酸方面都是采用水解工序与提取工序独立分批的传统方式，难于同时兼顾到提高产量质量和降低成本，给产业化生产带来了难点。

发明内容：

为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种低分子量透明质酸的提取及制备方法，能够有效的解决酸碱提取时，透明质酸容易发生分解和结构破坏的问题；

解决的第二个技术问题是：在提取过程中一些非糖物质被提出，如透明质酸外具有糖蛋白，糖蛋白在后续粗多糖的分离纯化会比较困难。

本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：

兽疫链球菌，该菌株于2020年11月23日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为：CGMCC NO.17774，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株命名为ps01，兽疫链球菌S.zooepidemicus；

一种重组表达质粒，其特征在于所述质粒的载体基于pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；

所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主细胞为产透明质酸的兽疫链球菌；

所述表达蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

所述的蛋白酶基因的聚核苷酸编码蛋白的氨基酸序列如SEQNO.2所示。

一种根据所述的重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法：其特征在于包括如下步骤：

第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，连接到所述载体pCOLADuet-1 上，构建表达载体pCOLADuet-1-S1；

引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；