[发明专利]基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法

说明书

本发明公开了基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt‑MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；A2：将活细胞抗体和opt‑MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；A5：将混合液4培养4‑6小时，用PBS溶液清洗2‑3次，完成染色。本发明不需要进行细胞膜打孔，利用抗体，使得活细胞的荧光染色范围和固定细胞免疫荧光染色范围一样；同时，该方法只需要4‑6个小时即可，时间明显缩短。

技术领域

本发明涉及免疫分析和生物技术应用领域，具体涉及基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法。

背景技术

目前国内的活细胞染色方法包括：1、中国专利“活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法”，专利号“201410061287.9”，该方法利用脂质体作为载体进行细胞内染色，方法需要22-26个小时且只针对直接带有荧光标记的抗体；2、中国专利“一种活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法”，专利号“201910633999.6”，该方法对细胞活性有一定的影响，且染色效率不高。

目前常规的活细胞的染色一般通过化学荧光染料实现，化学荧光染料进行染色的范围非常有限，且不是蛋白质特异性而是化学结构特异性的。目前常规的荧光染色一般通过细胞膜打孔实现，细胞膜打孔会影响细胞活性，容易造成细胞死亡，增加细胞碎片的产生，影响流式细胞学检测结果。目前常规的荧光染色时间也比较长，影响实验的效率。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供一种基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，不需要进行细胞膜打孔，利用抗体，使得活细胞的荧光染色范围和固定细胞免疫荧光染色范围一样；同时，该方法只需要4-6个小时即可，时间明显缩短。

本发明通过下述技术方案实现：基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:12-13充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:45-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比50-55:50-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为50-55:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

进一步，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

进一步，所述步骤A2中，活细胞抗体为细胞核内蛋白一抗和二抗混合物，一抗和二抗的重量份数比为1:1。

进一步，所述步骤A2中，活细胞抗体为荧光标记的细胞内蛋白抗体。

进一步，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：