[发明专利]一种改进的纯化可溶性果蝇TRP离子通道蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种改进的纯化可溶性果蝇TRP离子通道蛋白的方法。本发明方法是通过培养w[1118]品系的野生型果蝇，借由分离得到的果蝇头部，在含有十二烷基‑β‑D‑麦芽糖苷（N‑Dodecyl‑β‑D‑maltoside,DDM）去垢剂的缓冲液中，以6xNORPA863‑1095蛋白为诱饵，对INAD蛋白复合物进行亲和纯化，然后用PGEX‑4T‑1载体表达GST‑TRP‑CT 1260‑1275蛋白进行竞争性洗脱，得到可溶性的TRP离子通道蛋白，最后使用凝胶层析得到电泳单一条带的果蝇TRP离子通道蛋白。使用本方法将使得果蝇TRP蛋白可以通过野生型果蝇直接表达，大大降低了使用昆虫细胞纯化蛋白的生产成本和生产难度。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及从果蝇头部对TRP离子通道蛋白进行体外纯化的方法。

背景技术

瞬时受体电位（Transient receptor potential，TRP）离子通道超家族是一类在动物体内广泛表达的阳离子通道，参与了细胞内多种信号转导通路，并在生物体感知外部环境的过程中发挥重要作用。由于TRP离子通道广泛参与机体生理功能的维持以及疾病病理的进程，因此，对其功能及调控机理的研究具有重要的科学意义和广阔的应用转化前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的从果蝇头部纯化可溶性果蝇TRP离子通道蛋白的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

通过培养w[1118]品系的野生型果蝇，借由分离得到的果蝇头部，在含有十二烷基-β-D-麦芽糖苷 （N-Dodecyl-β-D-maltoside, DDM）去垢剂的缓冲液中以PETM3C载体表达的6xHis-NORPA 863-1095蛋白为诱饵，对INAD复合物进行亲和纯化，然后用PGEX-4T-1载体表达的GST-TRP-CT 1260-1275蛋白进行竞争性洗脱，得到可溶性的TRP离子通道蛋白，最后使用凝胶层析得到纯的果蝇TRP离子通道蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将使得果蝇TRP蛋白可以通过野生型果蝇直接表达，大大降低了使用昆虫细胞纯化蛋白的培养基生产成本和生产难度。

附图说明

图1 PETM3C载体表达的6xHis-NORPA 863-1095蛋白的分子筛层析纯化（A，PETM3CNORPA 863-1095蛋白分子筛色谱图 B， PETM3C NORPA 863-1095蛋白SDS-PAGE图）；

图2 PGEX-4T-1载体表达的GST-TRP-CT 1260-1275蛋白的分子筛层析纯化（A，GST-TRP-CT 1260-1275蛋白分子筛色谱图 B， GST-TRP-CT 1260-1275蛋白SDS-PAGE图）；

图3 果蝇TRP离子通道蛋白的亲和层析纯化SDS-PAGE图；

图4 果蝇TRP离子通道蛋白的凝胶层析纯化（A，果蝇TRP通道蛋白分子筛色谱图B， 果蝇TRP通道蛋白SDS-PAGE图）。

具体实施方式

果蝇头部组织裂解

1.1组织裂解液(lysis buffer)配方：50mM Tris-HCL pH8.0、150mM NaCL、1mMDTT、6mM DDM、1×cocktail protease inhibitor(Roche)；

1.2 取出保存在-80℃的装有果蝇的50ml离心管，液氮速冻10min，剧烈摇晃1min使果蝇头部和身体分离，依次经过20/30/40目的筛网筛选得到果蝇头部，-80℃保存备用；

1.3 将0.5g果蝇头放入提前预冷的研钵中，分次倒入液氮，用研杵将果蝇头研磨成粉末状，收集粉末加入10倍体积组织裂解液；

1.4 4℃，14000g，离心20min；

1.5 收集上清，100000g离心机，4℃，离心60min，收集上清4℃储存备用。