[发明专利]一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。所述枯草芽孢杆菌是通过紫外诱变方法筛选获得的中性蛋白酶产量显著提高的突变菌株，保藏编号为CGMCC No.19499。所述菌株可广泛应用于中性蛋白酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

六十年代末欧美诸国将蛋白酶加入洗涤剂内，促进了洗涤剂工业一次大的变革，七十年代随着生物工程的兴起和发展，拓展了核酸和蛋白质工程的新领域，兴起了工具酶新型产业，而生物技术用于改造酶的产生菌，则进一步促进了酶学研究和酶制剂工业的发展，因此酶已成为有关国际学术会议的中心议题。由于碱性蛋白酶和酸性蛋白酶所要求的反应条件限制了它的广泛应用，从八十年代初开始，国内外相继开展对中性蛋白酶的研究。

中性蛋白酶是最适作用 pH 介于 6.0-7.5 之间的一类蛋白酶，作为一种生物催化剂，它具有催化的反应速度快，无工业污染等优点。而且耐热性相对较低，在食物蛋白水解物的生产过程中成为控制酶活力的关键。大多数微生物中性蛋白酶是含有金属元素，部分酶蛋白含有一分子锌，起着酶同底物之间的桥梁作用，有些酶的分子中尚含若干原子钙，钙离子能增加中性蛋白酶的稳定性。

蛋白酶的来源广泛，如动植物、微生物均可产生蛋白酶。从动物的体内获取蛋白酶需要宰杀大量动物，而从植物体内纯化酶工艺难度较大，因此动植物来源性的蛋白酶的应用受限制。而微生物生长的繁殖速度快，而且微生物来源的蛋白酶大部分为外源酶，提取工艺相对简单，所以关于微生物发酵产蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的一个热点。 微生物来源的蛋白酶分为细菌性中性蛋白酶、真菌性中性蛋白酶以及其它来源的中性蛋白酶，大多数市售中性蛋白酶大都产自于芽孢杆菌属，比如 Bacillus subtilis, B.thuringiensis, B. pumilus, B. polymyxa, B. licheniformis等。很多真菌都能产生中性蛋白酶，比如米曲霉、根霉和毛霉等。

目前中性蛋白酶已被广泛的应用于食品、皮革、毛皮、化妆品、医药等行业。其中，在畜禽饲料配方中添加中性蛋白酶，可有效提高蛋白质的利用率和降低饲养成本；另外，中性蛋白酶具有较强的脱毛能力，能够避免传统的皮革加工使用硫酸钠进行处理造成的环境污染；中性蛋白酶应用于啤酒生产中，可排除蛋白质产生的“冷浑浊”现象；在洗涤剂用品中加入中性蛋白酶可大大提高洗涤效果；在医药行业中，中性蛋白酶还可作为消化、消炎、化痰止咳等药物，以及用于治疗跌打伤、水肿血肿，消除坏死组织等。

蛋白酶商品的生产最早可以追溯到 20 世纪初期，1956 年以来我国也陆续选育出了一大批优良的产蛋白酶菌株，如枯草杆菌 1.398、放线菌 166 等。目前，市场上大部分中性蛋白酶均来源于芽孢杆菌属。但经过长期的传代都面临菌种退化、产酶能力下降、发酵不稳定等问题。如何获得新的产中性蛋白酶菌株、提高菌株产酶能力仍是当前的研究重点。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其应用。申请人首先构建得到重组表达中性蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得中性蛋白酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达中性蛋白酶的重组质粒。

所述中性蛋白酶的基因序列为SEQ ID NO:3。

本发明一方面提供了一种突变菌株枯草芽孢杆菌QJNP（Bacillus subtilis QJNP），已于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19499。