[发明专利]一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。所述检测试剂盒包括：组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；组分B：GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水或者纯化的GNP单克隆抗体；组分C：生物素偶联的GNP多肽；组分D：用于稀释纯化的GNP单克隆抗体或者GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水的样品稀释液；组分E：用于稀释生物素偶联的GNP多肽的分析缓冲液；组分F：GNP标准品；组分G：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG；组分H：用于稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的抗体稀释液；组分G：TMB底物；组分I：终止液。本发明基于有限的抗原表位构建竞争性的分析方法，成功构建了GNP多肽的检测试剂盒。

技术领域

本发明属于药物分析领域，涉及GNP多肽的药代动力学和毒代动力学研究领域，具体涉及一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

GNP多肽，也可以称为“G型利钠肽”或者“GNP”，最初在非洲东部地区的一种窄头树眼镜蛇毒液中发现，是与BNP相似的天然类似物，也是利钠肽家族的新成员，具有极高药用价值。GNP多肽的一级结构中含有38个氨基酸序列，分子量约为3689Da。GNP比BNP相差6个氨基酸，且同源性差异很大，仅48.3%的同源性，但是可以发挥类似于BNP的作用，例如增加靶细胞环鸟苷酸的水平，促进平滑肌细胞舒张，促使静脉和动脉血管扩张，发挥利尿钠、利尿、血管扩张、平滑肌松弛的作用。目前国内外许多药物公司开发GNP多肽，且主要通过合成途径制作GNP多肽。但是当前尚未有相关报道涉及GNP多肽的检测方法，市场上也没有提供对应的GNP多肽检测试剂盒。基于GNP多肽药物分子的研发需求，构建GNP多肽的检测试剂盒及检测方法迫在眉睫。

如上所述，GNP是新发现的外源性多肽分子，GNP与内源的BNP相比不仅相差了6个氨基酸数目，而且序列上同源性很小，仅48.3%的同源性，无表位重叠性可言，GNP和BNP在来源和结构上的差异都决定BNP的检测对GNP完全无可参照性。另有脑利钠肽前体是BNP的前体物质，与GNP也属于不一样的功能物质，其氨基酸数目是76个，远远大于GNP，分子量大，潜在表位相对多，因此对脑利钠肽前体而言容易制备纯化抗体，更可以构建双抗体夹心的检测模式。但是本发明针对的GNP多肽是小肽，氨基酸数目相较GNP前体肽而言少一半，GNP多肽和脑利钠肽前体无论是来源、结构大小、检测试剂开发难易均也不具备可比拟性和参照性。总之，本发明是要针对一个新的非内源性来源的多肽构建检测试剂盒和检测方法。

发明内容

GNP检测试剂盒的开发完全是针对一个不同的新的肽类分子。无论是抗体制备纯化、分子标记，还是检测缓冲液（Assay Format）的构建都是所要面临的全新技术性问题和实施过程中必须克服的技术性挑战。总体而言，当前构建GNP多肽的检测试剂盒及检测方法主要存在以下技术问题：

（1）GNP主要用于治疗心脑血管类疾病，给药剂量很低，通常是ug/kg级别，因此GNP多肽的检测试剂盒对灵敏度要求极高，需要达到纳克级以下，且检测方法在药物分析实践中需要涵盖多个半衰期，还要兼顾小动物实验中样品量少的特点。

（2）GNP作为小肽物质，不稳定性突出，尤其是未经任何修饰的GNP裸肽在血液和缓冲液（例如分析缓冲液）中极不稳定，故在检测试剂盒的构建过程中需要克服其不稳定性。

（3）GNP仅含38个氨基酸，属于很短的小肽，表位非常有限，对其标记存在极高难度，相应的抗体也难以制备，这使得双抗体夹心法难以用于GNP检测试剂盒的构建，这无疑进一步增加了使得该检测试剂盒实现良好检测效果的难度。

针对上述问题，本发明提供一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法，既可以达到很高的灵敏度，提高信号，还可以在样品用量少于常规用量（50~100μL）的情况下，获得良好的检测效果。

第一方面，本发明提供一种GNP多肽的检测试剂盒。所述检测试剂盒包括：

组分A：预先包被链霉亲和素的微孔酶标板；