[发明专利]一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法

说明书

本发明提供的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，包括：组织预处理、组织切割、寻找活动精子、组织培养、分离组织、提取、配制悬液等步骤，本发明操作步骤简单明确易操作，减少外界污染的机会，可以高效解决现有技术中对睾丸组织切割不充分和睾丸组织浪费的问题，减少精子损失，增加获得单个活动精子的机会，对患者精子研究和临床辅助生育治疗极其重要。

技术领域

本发明涉及一种精子悬液的制备方法，特别涉及一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法。

背景技术

无精症是指射出的精液离心后使用显微镜观察，连续3次以上均未发现精子，不育人群中发生率为15％。其中，生精功能受损而导致生精障碍，称为非梗阻无精子症(NOA)，其治疗非常困难。在单精子卵胞浆内注射技术(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)出现以前，NOA患者只能通过供精方式生育子代。ICSI技术使仅有数个精子的患者也能拥有自己的孩子。所以对于NOA患者精子的收集和研究，需要通过外科取精手术获取睾丸组织进而获得活动精子。

经过近年的临床实践，发现通过显微镜下取精手术，可以获得微量的精子，提出睾丸内存在局部生精灶。通过显微取精手术所获得的可能含有精子的睾丸生精小管非常少，取得样本是微量的，一般长度小于0.5cm。目前，从睾丸组织获取精子的相关技术方法有两种，机械切碎法和酶消化法。酶消化法需要消化0.5-1个小时才能溶解生精小管管壁，耗时较长而且影响精子活力，不能快速获得活体精子且不损伤活体精子，不能充分满足试管婴儿对活体精子的要求。机械切碎法常使用玻片、注射针或穿刺针等进行切割，缺少专用的切割工具，存在切割的不细致而导致生精小管片段较大，切割效果差、切割效率低，不能保证活体精子从曲细精管里充分释放出来，造成组织浪费，进而降低获得活体精子的机会，影响精子悬液的制备效果。现有的相关专利、技术比较复杂，操作步骤较多，增加了外界污染的机会，并且使得微量的睾丸组织和活体精子粘附于装置而有所损失，缺少快速高效的获取活体精子并制成活体单精子悬液的制备方法，因此需要开发一种更高效的体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，包括以下步骤：

(1)组织预处理：

将显微手术获得的睾丸组织立即放入盛有精子洗涤培养液的培养皿中，并用精子洗涤培养液清洗睾丸组织后备用；

(2)组织切割：

在培养皿中，将数块睾丸组织集中，使用两支本发明独创的睾丸组织体外切割手术刀的刀刃相互穿插、交错，不断切割、分离睾丸组织，直到肉眼可见的块状组织全部切碎；

(3)寻找活动精子：

在倒置显微镜下，观察上述培养皿内有无精子存在以及精子是否活动，发现足够后续手术所需量的活体精子即可结束睾丸切开的手术；

(4)组织培养：

把上述培养皿里切碎的组织，用巴氏吸管加入2ml-3ml精子洗涤培养液充分吹打混匀后，转移到无菌离心管A中，离心管管盖拧紧放置在37℃培养箱中过夜培养；

(5)分离组织：

将离心管A放入高速离心机，采用瞬时离心法去除睾丸组织切割后的碎片，所述的瞬时离心法具体操作为：启动离心后，当达到200g离心力时立即按停止键，待离心机停止转动，小心取出离心管A，用巴氏吸管吸取上清液转移到37℃预温的无菌离心管B中，离心管B中盛有3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液；

(6)提取：

使用巴氏吸管将离心管B中组织液体充分吹打混匀，再放入高速离心机，用400g-600g离心力离心5分钟；离心停止后，使用巴氏吸管至上而下缓慢轻柔地吸取上清液并丢弃，保留0.3ml底部沉淀液体；