[发明专利]一种含密码子优化的结核分枝杆菌融合蛋白AH疫苗

说明书

本发明提供了一种密码子优化的结核分枝杆菌融合基因，以及相应融合蛋白、疫苗，在预防结核病中的应用和制备方法。通过将结核分枝杆菌感染早期分泌抗原Ag85A和潜伏期表达抗原HspX进行融合表达，两个抗原基因用柔性Linker(GGGGS)₃进行连接，根据大肠杆菌的DNA密码子偏嗜性对融合基因序列进行密码子优化，随后将基因序列连接到载体pET‑30a(+)用于大肠杆菌表达。用纯化的重组蛋白Ag85A‑HspX(简称AH)和聚肌胞(PolyI：C)对小鼠进行鼻内免疫，证实其具有良好的免疫原性和抗牛分枝杆菌感染的保护作用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域和疫苗领域，具体地本申请提供了一种密码子优化的结核分枝杆菌融合基因，以及相应融合蛋白、疫苗、在预防结核病中的应用和制备方法。

背景技术

结核病是一种主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，简称M.tb)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，简称M.bovis)引起的慢性传染性疾病，至今仍然威胁全球健康。作为全球十大死因之一，结核病也是单一传染病中的头号杀手。且耐药结核仍然是一项全球公共卫生威胁。因此，迫切需要开发安全有效的结核疫苗来减轻全球结核病负担。由于卡介苗(Bacille Calmette-Guérin，BCG)有较多的局限性，如对成人结核和潜伏性感染结核无效，越来越多的新型结核病疫苗正在不断的研发和临床验证中。据统计，目前已有14种结核候选疫苗正在开展临床试验。这些候选疫苗主要分为减毒活疫苗、灭活苗、蛋白佐剂疫苗和病毒载体疫苗。而由多种结核分枝杆菌优势抗原组成的蛋白佐剂疫苗在新型结核疫苗中占比较大，其优势在于安全性好，生产质量可控，成本较低等。

Ag85A是M.tb感染早期的主要分泌抗原之一，可介导M.tb的黏附和侵袭以及细胞壁的合成，能刺激Th1细胞产生多种细胞因子如TFN-α，IFN-γ等。Ag85A是最早进入临床阶段的新型痘病毒载体疫苗的抗原，但临床试验结果显示保护效果不佳，可能与含单一抗原有关。HspX蛋白又称Acr(Alpha-crystallin，α-晶体蛋白)，HPS16.3，16KDa抗原，是M.tb潜伏感染期的主要抗原之一，是一种有效的分子伴侣，在体外可以保护蛋白质不聚集。可诱导小鼠树突状细胞成熟和产生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ，是一个重要的新型结核疫苗候选抗原。由于仅含蛋白成分的蛋白亚单位疫苗免疫原性较弱从而不能诱导足够的免疫保护，通常需在蛋白亚单位疫苗中添加佐剂以提高其免疫原性。聚肌胞(polyinsinic-polycytidylic acid，poly(I:C)，简称P)是一种人工合成的由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基配对形成的病毒双链RNA类似物，是一种TLR3激动剂和有效的I型干扰素诱导剂，呼吸道黏膜免疫聚肌胞可增强流感疫苗的免疫保护作用。本发明将M.tb感染早期分泌抗原Ag85A和潜伏期分泌抗原HspX进行融合表达，构建多阶段融合蛋白疫苗AH。由于用Ag85A和HspX原始序列构建的重组融合蛋白在大肠杆菌中表达量低，纯化难度大，因此，本发明对融合基因序列进行密码子优化，经密码子优化后的融合蛋白AH表达量高，且经小鼠试验证实AH联合聚肌胞进行鼻内免疫具有较强的免疫原性和抗牛分枝杆菌感染的保护性作用，且能在免疫后的小鼠血清中检测到未经密码子优化的Ag85A或HspX特异性IgG抗体。本发明研究证实了经密码子优化的多阶段抗原融合蛋白疫苗AH可作为一种潜在的新型结核疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的含密码子优化的结核分枝杆菌融合蛋白疫苗，并将其用于预防结核。本发明通过AH联合聚肌胞进行鼻内免疫，然后用牛分枝杆菌感染小鼠建立感染模型证实其免疫原性和保护效力。

一方面，本申请提供了一种密码子优化的结核分枝杆菌融合基因，其特征在于，其包含结核分枝杆菌Ag85A基因和HspX基因。

进一步地，所述融合基因中以柔性Linker(GGGGS)₃进行连接Ag85A和HspX。

进一步地，所述融合基因核酸序列如SEQ ID NO.2所示。