[发明专利]一种乳糖含量检测的方法和试剂

说明书

本发明提供了一种乳糖含量检测的方法和试剂，所述方法为首先利用单糖氧化酶分解待检测样品中的单糖，产生的过氧化氢使用过氧化氢酶分解，过氧化氢酶的活性可以使用过氧化氢酶抑制剂消除，因此单糖以及单糖的消除过程不会对后续乳糖含量的检测产生影响。然后利用乳糖酶或者半乳糖甘酶分解待检测样品中的乳糖产生葡萄糖和半乳糖，葡萄糖和半乳糖在单糖氧化酶催化下产生过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶存在下通过与氢供体和氢受体的偶联反应使由此产生的过氧化氢形成有色醌。通过吸光光度法检测有色醌的含量，进而计算乳糖的含量。

技术领域

本发明涉及化学领域，特别是涉及一种乳糖含量检测的方法和试剂。

背景技术

乳糖由于存在于哺乳动物的乳汁中而得名，分子式C₁₂H₂₂O₁₁，由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合形成，分子量342.3。乳糖本身具有很高的营养价值，是儿童生长发育的主要营养物质之一，对于1岁以内的婴幼儿，乳糖是获取碳水化合物最主要也是最佳的来源。同时为人体的生长发育、新陈代谢、组织的合成，维持正常体温以及体育锻炼、劳动工作等提供大量的热能，因此乳糖是婴幼儿和成人奶粉中的主要成分。

同时乳糖也被广泛用做片剂和胶囊剂的填充剂或稀释剂，也可用于粉末吸入剂的稀释剂。但由于有些乳糖酶缺乏的人群对乳糖不耐受，因此服用以乳糖为辅料的药物还是会带来潜在的风险，临床表现常见于肠道乳糖酶缺乏的人群，乳糖不能被消化，可能出现腹腔痉挛、腹泻、腹胀很肠胃胀气等临床症状。

由此可见，在各种用途中，准确检测乳糖加入的含量高低、与其他配比的比例，显得尤为重要。乳糖的检测方法有很多种，例如高效液相色谱-串联质谱方法，高效液相色谱-蒸发光散射发、毛细管电泳法等，这些色谱检测的方法灵敏度和准确性很好，但是对于设备的要求比较高，检测投入较大。莱茵-埃农氏法即直接滴定法简便快速，但是由于滴定的是样品中的还原性糖，而乳制品中除了乳糖以外，常会添加葡萄糖，蔗糖等以调节口感，因此样品中若存在其他还原性糖对检测结果的影响较大。

酶学分析法也是现在常用的检测乳糖的手段，酶学分析法有以下几种方法：

1)先通过乳糖酶将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖，然后用半乳糖氧化酶将半乳糖氧化产生过氧化氢，在通过Trinder反应检测；该方法存在成本较高，且无法消除样品中半乳糖的干扰。

2)CN104237147B专利披露了先用试剂I中的己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶消除内源性的葡萄糖，然后通过试剂II中的乳糖酶将乳糖分解，产生的葡萄糖再与试剂I中的己糖激酶和6-磷酸葡萄糖反应，同时产生的NADPH吸光度反应乳糖的含量；该方法可以消除葡萄糖的干扰，但由于内源性葡萄糖产生的吸光度很高，影响试剂的检测范围和灵敏度。

3)CN108070635A专利使用了乳糖酶、葡萄糖氧化酶对粪便中的乳糖浓度进行了半定量的检测；该方法不能消除样本中葡萄糖、半乳糖等单糖的干扰。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种乳糖检测的方法和试剂，用于解决现有技术中乳糖检测复杂且不准确的问题。

本发明的构思如下:首先利用单糖氧化酶分解待检测样品中的单糖，产生的过氧化氢使用过氧化氢酶分解，过氧化氢酶的活性可以使用过氧化氢酶抑制剂消除，因此单糖以及单糖的消除过程不会对后续乳糖含量的检测产生影响。然后利用乳糖酶或者半乳糖甘酶分解待检测样品中的乳糖产生葡萄糖和半乳糖，葡萄糖和半乳糖在单糖氧化酶催化下产生过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶存在下通过与氢供体和氢受体(即过氧化物酶的氧化偶联色原底物对)的偶联反应使由此产生的过氧化氢形成有色醌。由于形成的色醌在400-700nm波长处有最大吸收峰(不同的色原底物对形成的色醌最大吸收波长有所不同)，所以在一定的底物浓度范围内，最大吸收波长处的吸光度变化值与样本中的乳糖的含量成正比，通过标准品的标定可以计算出样本中乳糖的实际含量。