[发明专利]一种表达双报告标签的重组副流感病毒5型

说明书

本发明的目的是提供一种共表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和NanoLuc荧光素酶(NLuc)的重组副流感病毒5型(PIV5)，其中用于拯救共表达eGFP和NLuc的重组PIV5核酸片段的结构为5′‑NP‑V/P‑eGFP‑T2A‑NLuc‑M‑F‑SH‑HN‑L‑3′；其中NP、V/P、M、F、SH、HN和L为PIV5的自身基因；eGFP‑T2A‑NLuc为融合序列；其中T2A为自剪切肽序列，负责“切断”eGFP和NLuc，将二者分离。本发明通过反向遗传技术拯救的重组PIV5，既不能导致MDBK细胞病变，也不能诱导空斑形成，但对于eGFP和NLuc的表达水平较高。重组PIV5的生长动力学与NLuc的表达动力学呈正相关。eGFP‑T2A‑NLuc融合序列在重组PIV5连续20次传代过程中基因较为稳定。

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达双报告标签的重组副流感病毒5型。

背景技术

副流感病毒5型(parainfluenza virus 5，PIV5)，旧称“猴病毒5型”，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正腮腺炎病毒属(Orthorubulavirus)成员。PIV5基因组为单股、负链、线性的RNA，全长15246nt，包含七个非重叠基因，顺序依次为3′-NP-V/P-M-F-SH-HN-L-5′，其中P基因包含V基因，对应编码V蛋白(非结构蛋白)。病毒经纯化后电镜下观察形状不定，但多呈球形或椭球形，外披脂质囊膜，囊膜外表面嵌有铆钉状纤突。囊膜内表面紧邻基质蛋白，其单体之间相互作用构成了整个病毒的外骨架，内部则含有鲱鱼骨状螺旋型核衣壳。

PIV5可感染多种哺乳动物，如牛、猪、犬等，也包括能感染人。该病毒除了引起狗的犬窝咳之外，通常不能导致其他易感动物表现出临床症状。另外，PIV5可感染多种细胞系，如Vero细胞、BHK细胞、MDBK细胞等，但通常不引起或只引起轻微的细胞病变，这便在多个方面限制了PIV5的应用，如病毒滴度测定。而表达荧光标签的重组PIV5，由于具有实时荧光指示作用，因此可以解决野生型病毒不诱导细胞病变所带来的限制。

发明内容

本发明目的是提供一种共表达增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescence protein，eGFP)和NanoLuc萤光素酶(NanoLuc luciferase,NLuc)的重组副流感病毒5型PIV5(rPIV5-GN)，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于拯救共表达eGFP和NLuc的重组PIV5核酸片段(rPIV5-GNcDNA clone)，所述核酸片段的结构如下：5′-NP-V/P-eGFP-T2A-NLuc-M-F-SH-HN-L-3′；其中，NP、V/P、M、F、SH、HN、L为PIV5病毒的自身基因；eGFP-T2A-NLuc为插入的融合序列；eGFP-T2A-NLuc的上游包含M基因起始序列(M GS)和Pme I酶切位点，下游包含Not I酶切位点及V/P基因终止序列(V/P GE)；

作为实施例的一种具体记载，所述重组PIV5核酸片段的序列为SEQ IDNO:1；

本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救能够共表达eGFP和NLuc的重组副流感病毒5型；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞和Madin-Darby bovine kidney(MDBK)细胞，两者分别用于重组病毒的拯救和传代；

本发明再一个方面提供一种能够共表达eGFP和NLuc的重组副流感病毒5型，所述的病毒是使用共表达eGFP和NLuc的重组PIV5核酸片段的重组质粒在细胞内拯救获得的。

本发明还提供用于检测所述的重组副流感病毒5型的引物对，其上游引物的序列为5′-GCAATCATCCGCAGTGCAATTTGA-3′；

下游引物的序列为5′-TGCGGGAATGCTGATGGATGGCAT-3′。