[发明专利]一种融合蛋白的快速分析方法

说明书

本发明公开了一种融合蛋白的快速分析方法，包含以下步骤：取融合蛋白进行变性后换液，换液后进行切糖处理后采用毛细管电泳进行分析，针对融合蛋白糖基化位点多、糖型复杂造成的峰形差、响应值不高的问题，提供了一种高效、准确的抗体纯度分析方法。

技术领域

本发明涉及生物分离分析领域，特别是涉及一种利用还原法毛细管电泳技术进行融合蛋白的快速分析方法。

背景技术

抗体是蛋白类大分子，具有复杂的结构特征，主要由Fab和Fc两大功能区组成，在Fab段和Fc段特定的位点存在糖基化修饰。糖基化修饰形成的糖链仅仅占整个抗体的3％，尽管比例不高，但糖链结构却发挥着极其重要的作用。据估计超过50％的人蛋白是糖基化的。许多健康和疾病生物标记是糖基化的蛋白质并且具体的糖形可以与健康或疾病状态关联。这包括与癌症、糖尿病、炎症和其它医疗状况以及发育相关的糖基化的蛋白质。另外，糖基化的蛋白质不仅仅限于人或哺乳动物，而是发现于所有真核系统以及原核生物、古细菌(Archaea)和植物中。糖基化修饰不仅对维持抗体的结构有重要作用，同时一些特定的糖基化修饰类型以及不同的糖基化修饰程度均会影响抗体的安全性特征，而且，糖基化修饰也影响药物的有效性。

抗体药物的糖基化形式主要为N-糖基化，涉及的单糖主要：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖、唾液酸(NANA、NGNA)。

毛细管电泳法是抗体类药物纯度分析最常用的方法之一，该方法通过在样品中加入过量的十二烷基硫酸钠，促使其中所有蛋白质分子带有相同的荷质比，并将带有相同荷质比的蛋白质分子引入到充满具有分离作用的凝胶的毛细管中，通过在毛细管两端施加电压，完成样品中不同分子量蛋白质成分的分离。

糖基化在蛋白质折叠、运输和稳定性以及细胞活动(如受体结合、细胞信号传导、免疫识别、炎症和致病)中起关键作用。真核生物来源的蛋白质通常因翻译后修饰而糖基化。具体的聚糖水平的变化通常用作多种疾病(包括糖尿病、癌症和传染病)的生物标志物。在N-连接和O-连接两者中，通过用PNGaseF酶切将N-连接聚糖与糖蛋白分离。

PNGaseF对蛋白质的去糖基化取决于以下因素，例如：聚糖的表面可接近性和大体积且高度支化的聚糖的空间位阻。这些因素分别间接地依赖于蛋白质整体构象和聚糖位点占据。所有这些因素将决定蛋白质上特定位点的去糖基化速率，这可以利用去糖基化物质的分子量的差异通过CE-SDS(十二烷基硫酸钠毛细管电泳)来监测。因此，含有糖蛋白上不同位点的去糖基化速率信息的部分去糖基化图谱可以作为其三级/四级构象的指纹。

蛋白质去糖基化后释放的聚糖可用于质量控制，还常用于确定蛋白质是否具有所需的治疗功效或其他效果。对于色谱绘图方案，通常需要将蛋白质和肽完全去糖基化。去糖基化可以减少通过SDS-PAGE使蛋白质分离期间的拖尾效应，或者可以在质谱分析期间更容易地进行电离和光谱解译。当观察可能因翻译后修饰丰富导致的异质性而歪斜的蛋白质的完整分子量时，这可能特别有用。在治疗性抗体的情况下，通常需要去糖基化来表征修饰，例如C-末端赖氨酸的存在，或者监测标记的单克隆抗体或与药物偶联的单克隆抗体中与免疫球蛋白偶联的小分子的数量。

抗体的糖基化修饰可能会在样品前处理、仪器进样分析等阶段对抗体样品纯度的检测产生影响，从而无法得到真实和准确的纯度检测结果。人体血浆IgG大约有20％包含Fab糖基化修饰，治疗性抗体中则一般选用单纯Fc N-糖基化修饰的结构。然而在少数治疗性抗体中，糖基化位点复杂，例如西妥昔单抗重链可变区含有一个N-糖基化位点。Fc的糖型为G1F，Fab的糖型为G4F(4个半乳糖)，分析方法开发困难，不易被高效、准确的检测出相应的纯度。所以针对糖基化位点多、复杂，糖型复杂的抗体或融合蛋白，会出现个别峰峰形差、响应值不高，为了保证抗体样品的关键质量属性被准确检测，防止蛋白质沉淀对分析方法的影响，开发相对应的高效、准确的抗体纯度分析方法非常必要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：