[发明专利]一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控装置及其应用

权利要求书

1.用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控芯片装置，其包含螺旋芯片和微孔阵列芯片，微孔阵列芯片上包含微孔阵列；

螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口。

2.根据权利要求1所述的用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控芯片装置，其特征在于，螺旋芯片中单螺旋型通道的横截面为矩形，其宽为500μm，高为170μm；

优选地，入口和出口的横截面为矩形，其中，内侧入口的横截面矩形的宽为425μm，外侧入口的横截面矩形的宽为75μm；内侧出口的横截面矩形的宽为150μm，外侧出口的横截面矩形的宽为350μm；入口和出口的高为170μm；

优选地，微孔阵列为PDMS材质；

优选地，微孔阵列尺寸为10×10mm，其上包含250×250个微孔，微孔的尺寸为20×20×50μm；

优选地，所述微流控芯片装置中还含有离心加载装置，微孔阵列芯片通过离心加载装置与螺旋芯片的内侧出口相连。

3.权利要求1或2中所述的微流控芯片装置在确认痰液中脱落肿瘤细胞方面中的应用。

4.一种确认痰液中脱落肿瘤细胞的方法，其基于权利要求1或2所述的微流控芯片装置，其包括：

将痰液样品由外侧入口注入单螺旋型通道，并在内侧入口通入鞘流液，样品与鞘流液以各自流速汇入单螺旋型通道，于通道内实现细胞分选；收集出口分选得到的细胞，并分别以单分散细胞的形式离心加载在微孔阵列芯片的微孔中；

对微孔中加载的单分散细胞进行原位RT-PCR检测，检测肿瘤标志物TERT和HK-2，根据单分散细胞中TERT和HK-2的荧光强度建立阈值，单分散细胞中TRET和HK-2的表达同时超过所述阈值，则认为该细胞为肿瘤细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，痰液样品的流速100μL/min；鞘流液的流速为800-900μL/min，优选为850μL/min；

优选地，所述鞘流液为PBS缓冲液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，痰液样品的细胞浓度为10²-10⁶cell/mL；

优选地，单分散细胞的离心加载浓度为10～500cell/μL，优选为10～100cells/μL。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，RT-PCR试剂包括2×reaction mix，SuperScript III RT Platinum Taq Mix，TERT荧光探针，HK-2荧光探针和RNase-free水；

优选地，所述荧光探针为TERT-FAM，HK-2-VIC；

优选地，所述原位RT-PCR扩增条件为：55℃孵育45min；95℃预变性6min；95℃60s、65℃60s，12个循环；95℃60s、60℃60s，18个循环；最后4℃冷却。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，TERT的阈值为35.70，HK-2的阈值为34.50。

9.一种基于痰液脱落肿瘤细胞的肺癌诊断系统，其包括：

细胞分选单元、RT-PCR检测单元和数据分析单元；

其中，细胞分选单元将待处理痰液作为样本通入分选单元，实现对痰液中细胞的分选，并获得单分散的细胞；

RT-PCR检测单元以TERT和HK-2为标志物对获得的单分散细胞进行原位RT-PCR检测，获取荧光数据并输送至数据分析单元；

数据分析单元将分选细胞的荧光强度与肿瘤细胞的TRET和HK-2荧光强度阈值进行比较，并输出比较结果。

10.根据权利要求9所述的肺癌诊断系统，其特征在于，所述细胞分选单元包含螺旋芯片、离心加载装置、微孔阵列芯片；

螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为痰液样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口；

微孔阵列芯片上包含微孔阵列，微孔阵列芯片通过离心加载装置与螺旋芯片的内侧出口相连。